DB21∕T 2591-2016 口蹄疫病毒非结构蛋白单抗阻断ELISA 检测方法

ICS11.220B41DB21辽宁省地方标准DB21/T2591—2016口蹄疫病毒非结构蛋白单抗阻断ELISA检测方法MonoclonalantibodyblockingELISAdetectionmethodoffoot-and-mouthdiseasevirusnonstructuralproteinantibody2016-03-18发布2016-05-18实施辽宁省质量技术监督局发布DB21/T2591—2016I目次前言...............................................................................III1范围..............................................................................12规范性引用文件....................................................................13缩略语............................................................................14检测方法..........................................................................14.1器材..........................................................................14.2试剂..........................................................................14.3试验步骤......................................................................24.4结果判定......................................................................24.4.1有效性判定................................................................24.4.2阻断率（Inh%）的计算......................................................24.5判定标准......................................................................24.5.1猪血清样品................................................................24.5.2牛、羊血清样品............................................................25废弃物处理........................................................................2附录A（资料性附录）主要试剂配方....................................................3附录B（规范性附录）采样与样品处理注意事项..........................................4DB21/T2591—2016II前言本标准根据GB/T1.1-2009的有关规定进行制定。本标准由辽宁省动物疫病预防控制中心提出。本标准由辽宁省畜牧兽医局归口。本标准由辽宁省质量技术监督局发布。本标准负责起草单位：辽宁省动物疫病预防控制中心、辽宁省动物医学研究院、世纪元亨生物技术有限公司。本标准起草人：杨本勇、赵晓彤、艾纯民、刘坤洋、李井春、杨作丰、张雅为、邓文超、孙明、陈西钊、赵铁柱、夏伟DB21/T2591—20161口蹄疫病毒非结构蛋白单抗阻断ELISA检测方法1范围本标准规定了口蹄疫病毒非结构蛋白3ABC抗体的酶联免疫吸附试验（ELISA）的检测方法、判定标准、废弃物处理等技术要求。本标准适用于猪、牛、羊口蹄疫病毒感染的检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法。GB16548－2006病害动物和病害动物产品生物安全处理规程。3缩略语下列缩略语适用于本标准。ELISA酶联免疫吸附试验（Enzymelinkedimmunosorbentassay）；FMDV口蹄疫病毒(Foot-and-mouthdiseasevirus)；FMDV-NS口蹄疫病毒非结构蛋白；OD450nm值450nm波长处的吸光值。TMB3，3´，5，5´四甲基联本胺4检测方法4.1器材量程为100µL的精确微量移液器，200µL8或12通道微量移液器，一次性移液器吸头，96孔血清稀释板，37℃避光孵育箱，1000mL量筒（配制洗涤液用），振荡器，酶标仪（含450nm波长滤光片），自动或手动洗板系统，吸水纸。4.2试剂包被有口蹄疫病毒非结构蛋白抗原的96孔ELISA板；辣根过氧化物酶标记的抗口蹄疫病毒抗原的单克隆抗体；含有0.05%（体积分数）Tween-20的磷酸盐缓冲液（PBS－T），0.01mol/L，pH7.4,配制方法见附录A.1章；含有0.1%（质量浓度）牛血清白蛋白的PBS-T，使用当日配制；含有TMB及过氧化氢尿素的柠檬酸-磷酸盐缓冲液，配制方法见附录A.2章；2mol/L硫酸溶液，配制方法见附录A.3章；本标准所用化学试剂除另有特殊规定外，均为分析纯。试剂配制用水需满足GB/T6682的要求。取动物全血，DB21/T2591—20162待血液凝固后，4000r/min离心10min，收集血清。要求血清清亮，无溶血。（血液采集与样品处理注意事项见附录B）4.3试验步骤4.3.1在稀释板上按1：1的体积比稀释待检血清（100µL样品稀释液+100µL待检血清）。4.3.2在记录表上记录阳性对照、阴性对照和样品的位置。分别在相应孔中加入阳性对照（2孔）和阴性对照（3孔）原液（不用稀释）、稀释好的待检血清各100µL。充分混匀后，贴上封板膜，置37℃孵育60min。4.3.3小心揭掉封板膜，弃去各孔中液体、拍净。每孔加满洗涤液，静置约30s，重复洗涤5次，最后在吸水纸上拍净。4.3.4每孔加入酶标抗体100µL，贴上封板膜，置37℃孵育30min。4.3.5小心揭掉封板膜，弃去各孔中液体、拍净。每孔加满洗涤液，静置约30s，重复洗涤5次，最后在吸水纸上拍净。4.3.6每孔加入底物液A50µL，再加入底物液B50µL，轻振混匀，置37℃避光显色10min。4.3.7每孔加入终止液50µL，轻振混匀，置酶标仪450nm波长处测定各孔OD450值。4.4结果判定4.4.1有效性判定阴性对照OD450平均值-阳性对照OD450平均值应≥0.6，阳性对照阻断率均≥55%时试验成立，否则重做。4.4.2阻断率（Inh%）的计算阻断率（Inh%）=（阴性对照孔OD450均值-样品孔OD450值）/阴性对照孔OD450均值×100%4.5判定标准4.5.1猪血清样品——被检样品阻断率（Inh%）≥30%，判为FMDV-NS抗体阳性；——被检样品20%≤阻断率（Inh%）＜30%，判为FMDV-NS抗体可疑；——被检样品阻断率（Inh%）＜20%，判为FMDV-NS抗体阴性。4.5.2牛、羊血清样品——被检样品阻断率（Inh%）≥40%，判为FMDV-NS抗体阳性；——被检样品25%≤阻断率（Inh%）＜40%，判为FMDV-NS抗体可疑；——被检样品阻断率（Inh%）＜25%，判为FMDV-NS抗体阴性。5废弃物处理检测过程中的废弃物，应收集后按CB16548－2006的要求处理。DB21/T2591—20163AA附录A（资料性附录）主要试剂配方A.1洗涤液磷酸二氢钾（KH2PO4）0.20g磷酸氢二钠（NaHPO4•12H2O）2.90g氯化钠（NaCl）8.00g氯化钾（KCl）0.20g吐温20（Tween-20）0.50mL加蒸馏水或去离子水至1000mLA.2底物溶液A液：TMB20.00mg用10ml无水乙醇充分溶解，加超纯水定容至100ml。B液：水柠檬酸（C6H8O7•H2O）2.10gNa2HPO42.82g75%过氧化氢尿素0.64ml蒸馏水或去离子水定容至100mlA.3终止液178.3ml超纯水中，逐滴加入浓硫酸21.7ml。DB21/T2591—20164BB附录B（规范性附录）采样与样品处理注意事项B.1血样采集及处理过程，应进行无菌操作，防止样本因污染发生变质。存放血样的容器应无菌，或使用一次性灭菌容器。B.2血液自然凝固后无菌分离血清装入灭菌离心管或小瓶中，加盖密封后冷藏保存。每份血清样品贴标签并写明编号、采集地点、免疫背景、时间等，以便通过抗体检测，做出追溯性诊断。B.3采样及实验过程，应戴口罩、穿工作服和戴一次性手套。B.4血样处理及检测过程中产生的废弃物应放入专门的废弃物容器，废弃物经高压消毒后按有关规定处理。B.5应符合《病原微生物实验室生物安全管理条例》的其它生物安全技术要求。_________________________________