DB21∕T 2536-2015 副结核分支杆菌实时荧光PCR检测方法

ICS65.020.30B41DB21辽宁省地方标准DB21/T2536—2015副结核分支杆菌实时荧光PCR检测方法Methodofthereal-timeRT-PCRforthedetectionofMycobacteriumaviumsubsp.paratuberculosis2015-10-15发布2015-12-15实施辽宁省质量技术监督局发布DB21/T2536—2015I前言本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准由辽宁出入境检验检疫局提出并归口。本标准起草单位：辽宁出入境检验检疫局。本标准主要起草人：吴斌、万超、屈菲。DB21/T2536—20151副结核分枝杆菌实时荧光PCR检测方法1范围本标准规定了副结核分枝杆菌（Mycobacteriumaviumsubssp.paratuberculosis）实时荧光PCR检测方法。本标准适用于副结核分枝杆菌的检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法SN/T1193基因检验实验室技术要求3缩略语下列缩略语适用于本文件。Ct值：达到阈值的循环数（CycleThreshold）DEPC：焦碳酸乙二酯（Diethylpyrocarbonate）Taq酶：TaqDNA聚合酶（TaqDNApolymerase）RNA：核糖核酸（RibonucleicAcid）实时荧光PCR：荧光逆转录聚合酶链反应（RealTimeFluorescentQuantitativeReverseTranscriptionPolymeraseChainReaction）4原理采用TaqMan方法，比对副结核分枝杆菌基因组5'端非编码区最保守的核苷酸序列，设计特异性引物和特异性的荧光双标记探针进行配对。探针5'端标记FAM荧光素为报告荧光基团（用R表示），3'端标记TAMRA荧光素为淬灭荧光基团（用Q表示），它在近距离内能吸收5'端荧光基因发出的荧光信号。PCR反应进入退火阶段时，引物和探针同时与目的基因片段结合，此时探针上R基团发出的荧光信号被Q基因所吸收，仪器检测不到荧光信号；而反应进行到延伸阶段时，Taq酶的5'到3'的外切核酸酶功能将探针降解。这样探针上的R基团游离出来，所发出的荧光不再为Q所吸收而被检测仪所接收。随着PCR反应的循环进行，PCR产物与荧光信号的增长呈现对应关系。5试剂和材料DB21/T2536—20152除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水；所有试剂均用无RNA酶的容器分装。5.1试剂5.1.1PBS：配制方法见附录A.1。5.1.2Triton-X-1005.1.3Trizol裂解液。5.1.4三氯甲烷。5.1.5柠檬酸钠-磷酸盐缓冲液：配制方法见附录A.2。5.1.675%乙醇：配制方法见附录A.3。5.1.7异丙醇（-20℃预冷）。5.1.84%氢氧化钠：配制方法见附录A.4。5.1.94%硫酸：配制方法见附录A.5。5.1.10其他试剂：荧光PCR反应缓冲液：含50mmol/LKCl：配制方法见附录A.6,10mmol/LTris-HCl（pH8.3）：配制方法见附录A.7,2.5mmol/LMgCl2：配制方法见附录A.8,5%二甲基亚砜（DMSO）：配制方法见附录A.9，5%甘油：配制方法见附录A.10。可采用等效商品化试剂。5.1.11dNTPMixture(各10mM)、EX-Taq酶(5U/μL)，UDG酶。5.1.12引物：以副结核F57基因序列合成一对特异性引物：上游引物5'-GTCAGCGGCGGTCCAG-3'，下游引物5'-GCAGCTCCAGATCGTCATTC-3'，TaqMan探针（FAM）5'-ACGAGCACGCAGGCATTCCAAGTC-3'（BHQ-1）均配制成10umol/L，-20℃保存。5.2仪器与耗材5.2.1接种棒5.2.2荧光PCR检测仪。5.2.3高速台式冷冻离心机（最高可达13000r/min）。5.2.4微量移液器：0.5μL～10μL，5μL～20μL，20μL～200μL，100μL～1000μL。5.2.5组织匀浆器。5.2.6冰箱(2℃-8℃)。5.2.7微量可调移液器。5.2.8离心管。5.2.9微量带芯吸嘴（10μL，100μL，1000μL）。5.3仪器与耗材6生物安全要求采样、样品处理及检测过程所涉及的实验操作，应遵守SN/T1193的有关规定。7操作步骤7.1样本的采集与处理7.1.1培养物：直接取液体培养基培养的菌液，对于在固体培养基上生长的菌落，用接种棒挑取适量菌样，放到0.01mol/LpH7.6PBS中，振荡混匀形成悬浮菌液。DB21/T2536—201537.1.2血样：用无菌注射器或真空采血管，无菌自动物静脉采血，无菌分离血清。7.1.3奶样：无菌采集奶液于灭菌的容器中。7.1.4粪便：选取新鲜粪便（腹泻或或有粘液、血液、粘膜的粪便），盛于灭菌容器中。7.1.5组织：选取有明显病变的肠段，回盲瓣以及病肠相邻部位的淋巴结。8操作方法8.1样品前处理8.1.1血样、培养物（菌液）前处理：取2ml全血样品或培养物（菌液），15000g离心10min，弃上清；加等体积灭菌双蒸水充分震荡，15000g离心10min，弃上清；收集沉淀物，继续进行核酸提取。8.1.2奶样前处理：取10ml奶液，加100μLTriton-X-100,震荡混匀，15000g离心10min，弃上清；加1ml0.01mol/LpH7.6PBS,充分振荡混匀，15000g离心10min，弃上清；收集沉淀物，继续进行核酸提取。8.1.3粪样前处理：取粪样2g，按1：5的比例加入4%硫酸溶液，充分振荡混匀，室温静置0.5h；取上层约3ml液体，5000g离心1min，取上清，15000g离心10min，弃上清；加等量0.01mol/LpH7.6PBS,充分振荡混匀，使沉淀充分悬浮，15000g离心10min，弃上清，重复本步骤一次；收集沉淀物，继续进行核酸提取。8.1.4组织样品前处理：取适量组织样品（剔除脂肪，被膜），剪碎，按1：5的比例加入柠檬酸钠-磷酸缓冲液，充分研磨；加等量4%氢氧化钠溶液，继续研磨5-10min，使组织液化；充分振荡混匀，75℃室温静置0.5h；取上层约3ml液体，5000g离心1min，取上清，15000g离心10min，弃上清；加等量0.01mol/LpH7.6PBS,充分振荡混匀，使沉淀充分悬浮，15000g离心10min，弃上清，重复本步骤一次；收集沉淀物，继续进行核酸提取。8.2核酸提取自上述完成前处理的样品中加入100μlDNA提取液，充分振荡混匀，55℃温浴30min，98℃加热10min，瞬时离心使液滴聚集管底，加等体积三氯甲烷，振荡混匀，12000g离心5min，取上清。粪便样品进行以下步骤：加3倍体积异丙醇，颠倒混匀，放置5min；4℃15000g离心10min，弃上清，加3倍体积70%乙醇，振荡洗涤；4℃15000g离心10min，弃上清，室温干燥5min；加入50μl无DNA酶、无RNA酶水，混匀、溶解核酸，直接用于PCR。也可采用经验证的商品化核酸提取试剂盒。8.3实时荧光PCR反应8.3.1反应体系8.3.2用漩涡混匀器将表1中各组分混匀后瞬间离心，备用。荧光PCR反应体系（25μL,核酸模板2μL），10×PCR缓冲液【10mmol/LTris-HCl(pH8.3)，50mmol/LKCl】2.5μL，2.5mmol/LMgCL25μL，10mmol/LDNTP2μL,上下游引物10μmol/L1μL，探针5μmol/L1μL，1UTaq酶。需配制的荧光PCR预混反应液数量=样品个数+对照个数+1。将各试剂按使用量吸取到微量离心管中，充分混匀，然后再每个PCR光学管中分装20μL。8.3.3反应参数DB21/T2536—20154将7.3.1中离心后的PCR管放入实时荧光PCR检测仪内，记录样本摆放顺序。循环参数设置如下：——第一阶段，预变性95℃3min；——第二阶段，95℃3s、60℃33s，40个循环；荧光收集设置在第二阶段每次循环的退火延伸时进行。9结果判定9.1结果分析条件设定读取检测结果。阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线的最高点，不同仪器可根据仪器噪音情况进行调整。9.2质控标准9.2.1阴性对照无Ct值并且无扩增曲线。9.2.2阳性对照的Ct值应≤28，并出现特定的扩增曲线。9.2.3如阴性对照和阳性对照条件不满足以上条件，此实验视为无效。9.3结果描述及判定9.3.1阴性判定无Ct值并且无扩增曲线，表明样品中无副结核分枝杆菌核酸。9.3.2阳性判定Ct值≤30，且出现特定的扩增曲线，表示样品中存在副结核分枝杆菌核酸。DB21/T2536—20155AA附录A(规范性附录)试剂的配制A.10.01mol/LpH7.6PBS先配制A液、B液。A液(0.2mol/LNaH2PO4溶液)：称取一水合磷酸二氢钠(NaH2PO4·H20)27.6g,或二水合磷酸二氢钠(NaH2PO4·2H20)31.2g，溶于蒸馏水中，定容至1L。B液(0.2mol/LNa2HPO4溶液)：称取十二水合磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H20)71.6g，或二水合磷酸氢二钠(Na2HPO4·2H20)35.6g，溶于蒸馏水中，定容至1L。称取17g氯化钠，用适量蒸馏水溶解，量取13mLA液和87mLB液，混合，用蒸馏水定容至2L。采用(121士2)℃/0.1Mpa,15min高压灭菌后贮存于4℃。A.2柠檬酸钠一磷酸缓冲液先配制pH6.8磷酸缓冲液。A液(O.2mol／L磷酸二氢钠溶液)：称取磷酸二氢钠(NaH2PO4·2H20)15.61g，加双蒸水溶解，定容至500mL。B液(O.2mol／L磷酸氢二钠溶液)：称取磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H20)35.82g，加双蒸水溶解，定容至500mL。分别量取51mLA液、49mLB液，混合即成100mLpH6.8磷酸缓冲液。称取2.84g柠檬酸钠(Na3C6H5O·2H2O)，加入100mLpH6.8磷酸缓冲液中，充分溶解。采用(121士2)℃／0.1MPa，15min高压灭菌后贮存于4℃。A.375％乙醇溶液量取75ml无水乙醇溶液，加入双蒸水中，充分混匀，定容至100ml。室温保存。A.44％氢氧化钠溶液称取8g氢氧化钠，加入双蒸水，充分溶解,定容至200ml。室温贮存。A.54％硫酸溶液98%的浓硫酸10ml，加入双蒸水，定容至450ml。室温贮存。A.650mmol/L氯化钾（50mmol/LKCl）称取3.73g氯化钾，加入双蒸水，充分溶解，定容至1000ml。室温贮存。A.710mmol/LTris-HCl称取0.3028gTris，用双蒸水溶解，然后用HCl调节pH至8.0，最后定容到250mL，室温贮存。A.82.5mmol/LMgCl2称取0.059gMgCl2，用双蒸水溶解，定容到250mL，室温贮存。DB21/T2536—20156A.95％二甲基亚砜量取5ml二甲基亚砜，加入双蒸水中，充分溶解，定容至100ml。室温贮存。A.610％甘油溶液量取10ml甘油，加入双蒸水中，混匀，定容至100ml。室温贮存。_________________________________