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ICS65.020.01B05DB41河南省地方标准DB41/T1210—2016农作物种子转基因成分检测方法2016-03-18发布2016-06-18实施河南省质量技术监督局发布DB41/T1210—2016I前言本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本标准由河南省农业厅提出。本标准起草单位：河南省种子管理站。本标准主要起草人：陈晓、戴钢、周新保、邓士政、徐立新、滕开琼、霍焕霞。本标准参与起草人：褚凰羽、张英华、张文玲、赵燕、宋新莉、肖琳琳、刘桂珍、闫瑾、韩赞平、吴刘记、常萍、刘景堂、杨晓明、李东升、王春源、程静、董根忠、郭瑞、郭敬东、李欣、魏艳敏、赵侠科。DB41/T1210—20161农作物种子转基因成分检测方法1范围本标准规定了农作物种子转基因成分检测的术语和定义、检测程序、实验室要求及污染防范、检测要求、仪器和设备、样品预处理、核酸提取与纯化、定性PCR反应及检测、结果判定及检测报告。本标准适用于农作物种子转基因成分检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T3543.2农作物种子检验规程扦样GB/T19495.2转基因产品检测实验室技术要求GB/T19495.4转基因产品检测核酸定性PCR检测方法农业部869号公告-3转基因植物及其产品成分检测抗虫和耐除草剂玉米Bt11及其衍生品种定性PCR方法农业部869号公告-4转基因植物及其产品成分检测抗除草剂油菜MS1、RF1及其衍生品种定性PCR方法农业部869号公告-5转基因植物及其产品成分检测抗除草剂油菜MS8、RF3及其衍生品种定性PCR方法农业部869号公告-6转基因植物及其产品成分检测抗除草剂油菜MS1、RF2及其衍生品种定性PCR方法农业部869号公告-7转基因植物及其产品成分检测抗虫和耐除草剂玉米TC1507及其衍生品种定性PCR方法农业部869号公告-8转基因植物及其产品成分检测抗虫和耐除草剂玉米Bt176及其衍生品种定性PCR方法农业部869号公告-9转基因植物及其产品成分检测抗虫玉米MON810及其衍生品种定性PCR方法农业部869号公告-10转基因植物及其产品成分检测抗虫玉米MON863及其衍生品种定性PCR方法农业部869号公告-11转基因植物及其产品成分检测抗除草剂油菜GT73及其衍生品种定性PCR方法农业部869号公告-12转基因植物及其产品成分检测耐除草剂玉米GA21及其衍生品种定性PCR方法农业部869号公告-13转基因植物及其产品成分检测耐除草剂玉米NK603及其衍生品种定性PCR方法农业部953号公告-1转基因植物及其产品成分检测抗虫玉米Bt10及其衍生品种定性PCR方法农业部953号公告-2转基因植物及其产品环境安全检测抗病水稻第2部分:生存竞争能力农业部953号公告-3转基因植物及其产品成分检测耐除草剂油菜T45及其衍生品种定性PCR方法农业部953号公告-4转基因植物及其产品成分检测抗除草剂油菜Oxy-235及其衍生品种定性PCR方法农业部1193号公告-2转基因植物及其产品成分检测耐除草剂油菜Topas19/2及其衍生品种定性PCR方法农业部1193号公告-3转基因植物及其产品成分检测抗虫水稻TT51-1及其衍生品种定性PCR方法DB41/T1210—20162农业部1485号公告-1转基因植物及其产品成分检测耐除草剂棉花MON1445及其衍生品种定性PCR方法农业部1485号公告-5转基因植物及其产品成分检测抗病水稻M12及其衍生品种定性PCR方法农业部1485号公告-6转基因植物及其产品成分检测耐除草剂大豆MON89788及其衍生品种定性PCR方法农业部1485号公告-7转基因植物及其产品成分检测耐除草剂大豆A2704-12及其衍生品种定性PCR方法农业部1485号公告-8转基因植物及其产品成分检测耐除草剂大豆A5547-127及其衍生品种定性PCR方法农业部1485号公告-9转基因植物及其产品成分检测抗虫耐除草剂玉米59122及其衍生品种定性PCR方法农业部1485号公告-10转基因植物及其产品成分检测耐除草剂棉花LLcotton25及其衍生品种定性PCR方法农业部1485号公告-12转基因植物及其产品成分检测耐除草剂棉花MON88913及其衍生品种定性PCR方法农业部1485号公告-13转基因植物及其产品成分检测抗虫棉花MON15985及其衍生品种定性PCR方法农业部1485号公告-14转基因植物及其产品成分检测抗虫转Bt基因棉花外源蛋白表达量检测技术规范农业部1485号公告-15转基因植物及其产品成分检测抗虫耐除草剂玉米MON88017及其衍生品种定性PCR方法农业部1782号公告-1转基因植物及其产品成分检测耐除草剂大豆356043及其衍生品种定性PCR方法农业部1782号公告-4转基因植物及其产品成分检测高油酸大豆305423及其衍生品种定性PCR方法农业部1782号公告-5转基因植物及其产品成分检测耐除草剂大豆CV127及其衍生品种定性PCR方法农业部1782号公告-10转基因植物及其产品成分检测转植酸酶基因玉米BVLA430101构建特异性定性PCR方法农业部1782号公告-11转基因植物及其产品成分检测转植酸酶基因玉米BVLA430101及其衍生品种定性PCR方法3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1农作物种子农作物的种植材料或者繁殖材料，包括籽粒、果实、根、茎、苗、芽和叶等。3.2转基因成分通过基因工程技术改变农作物遗传构成，被转入到农作物基因组中的外源核酸序列。3.3转基因成分检测方法依据已知转基因转化事件信息，筛选覆盖同一作物已知转化事件共有元件，并用这些元件快速、大批量筛查农作物种子，定性检测其是否含有转基因成分的检测方法。DB41/T1210—201633.4检出限在给定的置信度内，可从样品中检出待测成分的最小浓度或最小量。3.5阴性对照（阴参）不含待测基因的农作物种子或核酸样品。3.6阳性对照（阳参）含待测基因的农作物种子或核酸样品。3.7聚合酶链式反应(PCR)在反应溶液中，脱氧核糖核酸三磷酸、寡核苷酸引物在核酸聚合酶的作用下进行的催化反应。反应是一个循环的过程：通过加热使双螺旋核酸变性成为单链核酸、在合适的温度下引物和目标序列发生退火反应、在合适温度下结合在两条单链上的引物通过核酸聚合酶作用进行PCR延伸反应。3.8引物一条可互补结合在模板核酸链上的短的单链，提供3'-OH末端作为核酸合成的起点，延伸合成模板核酸目的片段。3.9内标准基因(内参)具有物种专一性且拷贝数恒定、不显示等位基因变化的保守核酸序列。3.10空白对照确知不含待测基因或低于检出限的样品。4检测程序农作物种子转基因成分检测程序见图1。图1农作物种子转基因成分检测程序DB41/T1210—201645实验室要求及污染防范按GB/T19495.2的规定执行。6检测要求6.1核酸制备6.1.1从送验样品中分取的试验样品应具有代表性，并有足够的数量。6.1.2鲜活样品及被破碎后的样品，应在-20℃下保存。6.1.3按照阴性、待测样品、阳性对照顺序提取核酸。6.1.4每一份核酸样品都应经过质量检测。6.2定性PCR检测6.2.1PCR反应设置仅模板不同的空白对照、阴性对照、阳性对照至少各2个重复，待检样品3个重复，对照与待检样品同步反应、检测。6.2.2最低检出限为0.1%，阳性参照的含量为0.1%。6.2.3检测为阳性的样品，可进一步根据转化事件检测方法，确认转化事件。具体检测方法见附录A。7仪器和设备7.1分样器。7.2样品粉碎机。7.3高速离心机（转速≥12000r/min）。7.4天平(量程分别为0.001g，0.01g，0.1g)。7.5移液器(量程分别为20µL，200µL，1000µL)。7.6高压灭菌锅。7.7高恒温烘箱。7.8生物安全柜。7.9冰箱。7.10微量核酸质量检测仪。7.11高速离心机（转速≥6000r/min）。7.12移液器(量程分别为2.5µL，10µL，20µL，100µL，200µL，1000µL)。7.13超净工作台。7.14制冰机。7.15不间断电源。7.16PCR循环仪。7.17电泳仪和电泳槽。7.18凝胶成像系统。7.19超纯水仪。8样品预处理DB41/T1210—201658.1从送验样品中分取的试验样品应不少于1000粒，方法按照GB/T3543.2扦样中实验室分样程序操作。8.2分取的样品，应经自来水和无菌水冲洗。8.3晾干后，用样品粉碎机将分取的试验样品粉碎至直径大小0.1mm以下的颗粒，充分混匀,冷冻备用。9核酸提取与纯化9.1SDS法快速制备核酸9.1.1试剂9.1.1.1无水乙醇（C2H5OH）。9.1.1.237％盐酸（HCl）。9.1.1.3氯仿（CHCl3）。9.1.1.4氢氧化钾（KOH）。9.1.1.5三羟甲基氨基甲烷（C4H11NO3，Tris）。9.1.1.6二水乙二铵四乙酸二钾盐（C10H14N2O8K2·2H2O，K2EDTA·2H2O）。9.1.1.7十二烷基磺酸钠（C12H25O4SNa，SDS）。9.1.1.8异戊醇（C5H12O）。9.1.1.9氯化钠(NaCl)。注：所有的试剂均分为析纯。9.1.2溶液配制9.1.2.11mol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸溶液（pH8.0）称取121.1g三羟甲基氨基甲烷溶解于约800mL水中，用1mol/L盐酸溶液调pH至8.0，加水定容至1000mL，灭菌备用。9.1.2.20.5mol/L乙二铵四乙酸二钾溶液(pH8.0)称取20.2g乙二铵四乙酸二钾，加入约70mL水中，再加入适量氢氧化钾，加热至完全溶解后，冷却至室温，用1mol/L氢氧化钾调pH至8.0，用水定容至100mL，灭菌备用。9.1.2.3提取/裂解缓冲液在约600mL水中加入30g十二烷基磺酸钠（SDS），充分溶解后，加入50mL三羟甲基氨基甲烷-盐酸溶液，100mL乙二铵四乙酸二钾溶液，用盐酸或氢氧化钾调pH至8.0，加水定容至1000mL，灭菌备用。9.1.2.45mol/LNaCl溶液146.25g固体NaCl溶于水中，加水定容至500mL。9.1.2.5TE缓冲液(pH8.0)在约800mL水中依次加入10mL三羟甲基氨基甲烷-盐酸溶液，2mL乙二铵四乙酸二钾溶液，用盐酸或氢氧化钾调pH至8.0，加水定容至1000mL，灭菌备用。9.1.2.6洗涤溶液DB41/T1210—20166量取750mL无水乙醇，加水定容至1000mL。9.1.3核酸提取9.1.3.1取30mg～80mg粉碎后的样品置入1.5ｍL尖底离心管中，加入600µL裂解溶液，65ºC水浴30min，期间颠倒混匀几次。9.1.3.2加入200µL氯仿，轻柔晃动5min。12000r/min离心10min。9.1.3.3转450µL上清至一新离心管中，加入450µL异戊醇,150µL5mol/LNaCL溶液,静置2min。9.1.3.4混合物分2次转入Spincolumn中，10000r/min离心60s。9.1.3.5加入700µL洗涤溶液，10000r/min离心30s。9.1.3.6重复9.1.3.5一次。9.1.3.7Spincolumn柱转入新的离心管中，敞盖放置5min，加入200µLTE缓冲液，室温静置2min，10000r/min离心1min。9.1.3.8检测管底液体产物浓度及质量，-20℃保存备用。9.2SLS法快速提取核酸9.2.1试剂9.2.1.1无水乙醇（C2H5OH）。9.2.1.237％盐酸（HCl）。9.2.1.3苯酚：氯仿：异戊醇=25：24：1.9.2.1.4异丙醇（C3H8O）。9.2.1.5氢氧化钾（KOH）。9.2.1.6三羟甲基氨基甲烷（C4H11NO3，Tris）。9.2.1.7二水乙二铵四乙酸二钾盐（C10H14N2O8K2·2H2O，K2EDT