DB61∕T 1001.3-2015 保健用品微生物限度检查 第3部分铜绿假单胞菌检验

ICS11.020C50DB61陕西省地方标准DB61/T1001.3—2015保健用品微生物限度检查第3部分：铜绿假单胞菌检验MicrobiallimitexaminationforhealthcaresuppliesPart3:Testsforpseudomonasaeruginosa2015-12-29发布2016-03-01实施陕西省质量技术监督局发布DB61/T1001.3—2015I目次前言................................................................................II 1范围..............................................................................1 2规范性引用文件....................................................................1 3术语和定义........................................................................1 4设备和材料........................................................................1 5培养基和试剂......................................................................2 6操作步骤..........................................................................4 7判定和报告........................................................................5 表1铜绿假单胞菌菌落形态特征.......................................................4 DB61/T1001.3—2015前言DB61/T1001《保健用品微生物限度检查》分为以下5个部分：——第1部分：总则；——第2部分：菌落总数测定；——第3部分：铜绿假单胞菌检验；——第4部分：金黄色葡萄球菌检验；——第5部分：霉菌和酵母菌数测定。本部分为DB61/T1001的第3部分。DB61/T998《保健用品安全性评价指导原则及试验方法》与DB61/T999《保健用品功能学评价指导原则及试验要求》、DB61/T1000《保健用品产品标准编写规范》、DB61/T1001《保健用品微生物限度检查》共同构成了陕西省保健用品系列地方标准。下面列出了这些地方标准的结构：a)DB61/T998《保健用品安全性评价指导原则及试验方法》分为以下6个部分：1)第1部分：安全性评价指导原则；2)第2部分：皮肤急性毒性试验；3)第3部分：皮肤长期毒性试验；4)第4部分：皮肤刺激性试验；5)第5部分：皮肤过敏性试验；6)第6部分：眼部刺激性试验。b)DB61/T999《保健用品功能学评价指导原则及试验要求》分为以下16个部分：1)第1部分：总则；2)第2部分：改善微循环类功能学评价动物试验；3)第3部分：改善微循环类功能学评价人体试验；4)第4部分：乳房保健类功能学评价动物试验；5)第5部分：乳房保健类功能学评价人体试验；6)第6部分：胃肠功能保健-助消化类功能学评价动物试验；7)第7部分：胃肠功能保健-助消化类功能学评价人体试验；8)第8部分：胃肠功能保健-通便类功能学评价动物试验；9)第9部分：胃肠功能保健-通便类功能学评价人体试验；10)第10部分：皮肤瘙痒类功能学评价动物试验；11)第11部分：皮肤瘙痒类功能学评价人体试验；12)第12部分：妇女卫生保健类功能学评价动物试验；13)第13部分：妇女卫生保健类功能学评价人体试验；14)第14部分：眼部保健类功能学评价人体试验；15)第15部分：改善睡眠、醒脑通窍保健类功能学评价动物试验；16)第16部分：改善睡眠、醒脑通窍保健类功能学评价人体试验。c)DB61/T1000《保健用品产品标准编写规范》分为以下8个部分：1)第1部分：总则；2)第2部分：保健贴类产品标准编写规范；DB61/T1001.3—2015III3)第3部分：眼贴类产品标准编写规范；4)第4部分：含药芯类产品标准编写规范；5)第5部分：喷涂类产品标准编写规范；6)第6部分：清洗液类产品标准编写规范；7)第7部分：器具类产品标准编写规范；8)第8部分：功能服装类产品标准编写规范。本部分根据GB/T1.1-2009给出的规则起草。本部分由陕西省食品药品监督管理局提出并归口。本部分起草单位：陕西省食品药品监督管理局、陕西省质量技术监督局。本部分主要起草人：杨晓莉、乔蓉霞、李伟、张扬。本部分由陕西省食品药品监督管理局负责解释。本部分首次发布。联系信息如下：单位：陕西省食品药品监督管理局电话：[phone]地址：西安市高新六路56号邮编：710065DB61/T1001.3—20151保健用品微生物限度检查第3部分：铜绿假单胞菌检验1范围DB61/T1001的本部分规定了保健用品中铜绿假单胞菌的检验方法。本部分适用于陕西省保健用品中铜绿假单胞菌的检验。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其昀新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。DB61/T1001.1-2015保健用品微生物限度检查第1部分：总则3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1铜绿假单胞菌pseudomonasaeruginosa铜绿假单胞菌属于假单胞菌属，为革兰阴性杆菌，氧化酶阳性，能产生绿脓菌素。此外还能液化明胶，还原硝酸盐为亚硝酸盐，在42℃±1℃条件下能生长。该菌对人有致病力，可使伤处化脓，引起败血症等病变。4设备和材料进行铜绿假单胞菌检验应具备以下设备和材料，并应符合其要求：a)恒温培养箱：温度应控制在42℃±1℃、36℃±1℃；b)冰箱：温度应控制在0℃～4℃；c)高压灭菌锅；d)显微镜：10×～100×；e)电子天平：感量为0.1g；f)电磁炉；g)振荡器或均质器；h)灭菌吸管：1mL（具0.01mL刻度）、10mL（具0.1mL刻度）；i)试管：10mm×100mm、18mm×180mm；j)丝口瓶或锥形瓶：容量为300mL、500mL；k)培养皿：直径为90mm；l)接种环和接种针；m)载玻片；n)pH计或精密pH试纸。DB61/T1001.3—20155培养基和试剂5.1无菌生理盐水无菌生理盐水应符合DB61/T1001.1-2015中3.6.3规定的要求。5.2SCDLP液体培养基制备应先将卵磷脂在少量蒸馏水中加温溶解后，再与其他成份混合，加热溶解，冷却至25℃±1℃，调节pH值至7.2～7.3，121℃灭菌20min。注意振荡，使沉淀于底层的聚山梨酯80与其他成份充分混合，冷却至25℃左右使用。各制备材料的种类和量应符合以下规定的要求（其中，无酪蛋白胨和大豆蛋白胨时也可用多胨代替）：a)酪蛋白胨：17g；b)大豆蛋白胨：3g；c)氯化钠：5g；d)磷酸氢二钾：2.5g；e)葡萄糖：2.5g；f)卵磷脂：1g；g)聚山梨酯80：7g；h)蒸馏水：1000mL。5.3十六烷基三甲基溴化铵培养基制备5.3.1十六烷基三甲基溴化铵培养基制备材料的种类和量应符合以下要求：a)牛肉膏：3g；b)十六烷基三甲基溴化铵：0.3g；c)蛋白胨：10g；d)琼脂：20g；e)氯化钠：5g；f)蒸馏水：1000mL。5.3.2十六烷基三甲基溴化铵培养基的制备方法应为：将除琼脂以外的上述成份混合加热溶解，冷却至25℃±1℃，调节pH值至7.4～7.6，加入琼脂，115℃灭菌20min后，制成平板备用。5.4乙酰胺培养基制备5.4.1乙酰胺培养基制备材料的种类和量应符合以下要求：a)乙酰胺：10.0g；b)硫酸镁（MgSO4.7H2O）：0.5g；c)氯化钠：5.0g；d)酚红：0.012g；e)无水磷酸氢二钾：1.39g；f)琼脂：20g；g)无水磷酸二氢钾：0.73g；h)蒸馏水：1000mL。5.4.2乙酰胺培养基的制备方法应为：将除琼脂和酚红以外的其他成份加入蒸馏水中，加热溶解，冷却至25℃±1℃，调节pH值至7.2，加入琼脂、酚红，121℃灭菌20min后，制成平板备用。DB61/T1001.3—201535.5绿脓菌素测定用培养基制备5.5.1绿脓菌素测定用培养基制备材料的种类和量应符合以下要求：a)蛋白胨：20g；b)琼脂：18g；c)氯化镁：1.4g；d)甘油（化学纯）：10g；e)硫酸钾：10g；f)蒸馏水：1000mL。5.5.2绿脓菌素测定用培养基的制备方法应为：将蛋白胨、氯化镁和硫酸钾加入蒸馏水中，加温使其溶解，冷却至25℃±1℃，调节pH值至7.4，加入琼脂和甘油，加热溶解，分装于试管内，115℃灭菌20min后，制成斜面备用。5.6明胶培养基制备5.6.1明胶培养基制备材料的种类和量应符合以下要求：a)牛肉膏：3g；b)明胶：120g；c)蛋白胨：5g；d)蒸馏水：1000mL。5.6.2明胶培养基的制备方法应为：取各成份加入蒸馏水中浸泡20min，随时搅拌加温使其溶解，冷却至25℃±1℃，调节pH值至7.4，分装于试管内，115℃灭菌20min后，直立制成高层备用。5.7硝酸盐蛋白胨水培养基制备5.7.1硝酸盐蛋白胨水培养基制备材料的种类和量应符合以下要求：a)蛋白胨：10g；b)亚硝酸钠：0.5g；c)酵母浸膏：3g；d)硝酸钾：2g；e)蒸馏水：1000mL。5.7.2硝酸盐蛋白胨水培养基的制备方法应为：将蛋白胨和酵母浸膏加入蒸馏水中，加热使其溶解，冷却至25℃±1℃，调节pH值至7.2，煮沸过滤后，补足液量，加入硝酸钾和亚硝酸钠，溶解混匀，分装到加有小倒管的试管中，115℃灭菌20min后备用。5.8普通琼脂斜面培养基制备5.8.1普通琼脂斜面培养基制备材料的种类和量应符合以下要求：a)蛋白胨：10g；b)牛肉膏：3g；c)氯化钠：5g；d)琼脂：15g；e)蒸馏水：1000mL。DB61/T1001.3—20155.8.2普通琼脂斜面培养基的制备方法应为：将除琼脂以外的其他成份加入蒸馏水中，加热使其溶解，冷却至25℃±1℃，调节pH值至7.2～7.4，加入琼脂，加热溶解，分装到试管中，115℃高压灭菌20min后，制成斜面备用。6操作步骤6.1样品的处理应按照DB61/T1001.1-2015中4.4的规定制备1:10样品匀液。6.2增菌和分离培养6.2.1应取10mL的1:10样品匀液加到90mL的SCDLP液体培养基中，在36℃±1℃条件下培养18h～24h。若有铜绿假单胞菌生长，则培养液表面多有一层薄菌膜，培养液常呈黄绿色或蓝绿色。6.2.2应从培养液的薄膜处挑取培养物，划线接种于十六烷三甲基溴化铵琼脂平板上，在36℃±1℃条件下培养18h～24h；在缺乏十六烷三甲基溴化铵琼脂时，也可划线接种于乙酰胺培养基平板上，在36℃±1℃条件下培养24h±2h。铜绿假单胞菌在不同培养基上的菌落形态特征见表1：表1铜绿假单胞菌菌落形态特征培养基菌落形态十六烷三甲基溴化铵琼脂菌落扁平无定型，向周边扩散或略有蔓延，表面湿润，菌落呈灰白色，菌落周围培养基常扩散有水溶性色素。乙酰胺培养基菌落扁平，边缘不整，菌落周围培养基略带粉红色。6.3染色镜检应挑取可疑菌落进行革兰氏染色，镜检结果应为革兰氏阴性杆菌。6.4氧化酶试验应取一小块洁净的白色滤纸片放在灭菌平皿内，用无菌玻璃棒挑取可疑菌落涂在滤纸片上，然后在其上滴加一滴新配制的1％二甲基对苯二胺试液；在15s～30s之内，若出现粉红色或紫红色，则为氧化酶试验阳性；若培养物不变色