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ICS65.020.30B41DB21辽宁省地方标准DB21/T2537—2015蓝舌病病毒荧光PCR检测方法Methodofthereal-timeRT-PCRforthedetectionofBluetonguevirus,BTV2015-10-15发布2015-12-15实施辽宁省质量技术监督局发布DB21/T2537—2015I前言本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准由辽宁出入境检验检疫局提出并归口。本标准起草单位：辽宁出入境检验检疫局。本标准主要起草人：吴斌、万超、孙铭英。DB21/T2537—2015蓝舌病病毒实时荧光PCR检测方法1范围本标准规定了蓝舌病病毒（Bluetonguevirus）实时荧光PCR检测方法。本标准适用于蓝舌病病毒的检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法SN/T1193基因检验实验室技术要求3缩略语下列缩略语适用于本文件。Ct值：达到阈值的循环数（CycleThreshold）DEPC：焦碳酸乙二酯（Diethylpyrocarbonate）Taq酶：TaqDNA聚合酶（TaqDNApolymerase）RNA：核糖核酸（RibonucleicAcid）实时荧光PCR：荧光逆转录聚合酶链反应（RealTimeFluorescentQuantitativeReverseTranscriptionPolymeraseChainReaction）4原理采用TaqMan方法，比对蓝舌病病毒基因组S基因的核苷酸序列，设计特异性引物和特异性的荧光双标记探针进行配对。探针5'端标记FAM荧光素为报告荧光基团（用R表示），3'端标记TAMRA荧光素为淬灭荧光基团（用Q表示），它在近距离内能吸收5'端荧光基因发出的荧光信号。PCR反应进入退火阶段时，引物和探针同时与目的基因片段结合，此时探针上R基团发出的荧光信号被Q基因所吸收，仪器检测不到荧光信号；而反应进行到延伸阶段时，Taq酶的5'到3'的外切核酸酶功能将探针降解。这样探针上的R基团游离出来，所发出的荧光不再为Q所吸收而被检测仪所接收。随着PCR反应的循环进行，PCR产物与荧光信号的增长呈现对应关系。5试剂和材料DB21/T2537—2015除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水；所有试剂均用无RNA酶的容器分装。5.1试剂5.4.1DEPC水（见附录A）。5.4.20.01mol/LPBS（见附录A）5.4.3Trizol裂解液。5.4.4三氯甲烷。5.4.5乳糖蛋白胨缓冲肉汤（BLP,见附录A）5.4.675%乙醇（见附录A）。5.4.7异丙醇（-20℃预冷）。5.4.8其他试剂：荧光PCR反应缓冲液：含50mmol/LKCl（见附录A）,10mmol/LTris-HCl（pH8.3）（见附录A）,2.5mmol/LMgCl2（见附录A）。可采用等效商品化试剂。5.4.9dNTPMixture(各10mM)、Taq酶(5U/μL)。引物：合成一对特异性引物：上游引物5'-GTTCTCTAGTTGGCAACCACC-3'，下游引物5'-TGCACTGCTCAGCAATCCA-3'，TaqMan探针（FAM）5'-AGTTCTCGTGGCATTTGCGTAATCC-3'（TAMRA）均配制成10umol/L，-20℃保存。5.2仪器与耗材5.4.1荧光PCR检测仪。5.4.2高速台式冷冻离心机（最高可达13000r/min）。5.4.3微量移液器：0.5μL～10μL，5μL～20μL，20μL～200μL，100μL～1000μL。5.4.4混匀器。5.4.5冰箱(2℃-8℃)。5.4.6研钵。5.4.7微量可调移液器。5.4.8离心管。5.4.9吸水纸。5.4.10离心管5.4.11微量带芯吸嘴（10μL，100μL，1000μL）。6生物安全要求采样、样品处理及检测过程所涉及的实验操作，应遵守SN/T1193的有关规定。7操作步骤7.1样本的采集与处理采样过程中样本不得交叉污染，采样及样品前处理过程中应戴一次性手套。7.4.1取样工具棉拭子、剪刀、镊子、研钵、离心管（Eppendorf管）。所有取样工具应经1.01×105Pa，15min高压灭菌并烘干。7.4.2采样方法DB21/T2537—20157.1.2.1组织样品用无菌的剪刀剪取待检样品5.0g后，再加10mlBLP(配方见附录A，含青霉素2000IU/ml、链霉素2000μg/ml)加入于研钵中充分研磨，4℃浸提4h,取上清液5ml用超声波裂解处理（100μA、1min）。经处理的样品当天使用，剩余样品-70℃保存备用。7.1.2.2血液样品取加入肝素（10IU肝素/5ml）抗凝血5ml，用磷酸盐缓冲液(PBS,配方见附录A),洗涤血样3-4次，每次2000r/min离心10min,弃上清液后加入倍量BLP（配方见附录A），置冰浴中超声波处理（40μA、1min）。经处理的样品当天使用，使用前置4℃保存，剩余样品-70℃保存备用。7.2核酸提取所有RNA提取器皿用DEPC水浸泡24h，灭菌后方可使用。自上述完成前处理的样品中加入1mlTizol裂解液，室温放置5min。加入0.2ml三氯甲烷，剧烈振荡15秒，室温放置3min，4℃10000g离心15min。将水相转移到新管中，加入500μl异丙醇(-20℃预冷)，室温放置10min，4℃10000g离心10min，吸取离心后的上清液转移至相应的新管中，上清液约吸取500μl（注意不要吸出中间白色絮状层），轻轻颠倒均匀。于4℃条件下，12000r/min离心15min。取出Eppendorf管，轻轻倒去上清液，加入1ml75%乙醇，颠倒洗涤。于4℃条件下，12000r/min离心15min。取出Eppendorf管，轻轻倒去上清液，倒置于吸水纸上，吸干液体，不同样品应在吸水纸不同地方吸干。每管加入20μl灭菌DEPC水，轻轻混均，溶解管壁上的RNA，2000r/min离心5s，冰上保存备用。提取的RNA应在2h内进行RT-PCR扩增或放置于-70℃冰箱备用。7.3反转录于7.2eppendorf管中依次加入：10×反转录酶缓冲液（200mMTris/HCl,pH8.4,和500mMKCl），2μl；下游引物4μl；dNTPs(10mMeachdATP,dCTP,dGTP,dTTP)，2μl；MgCl2(25mM)2.0µl；DTT（0.1M）2.0µl；AMV反转录酶(200units/µl)，0.5μl，补水至20μl。瞬时离心，97℃水浴5min,42℃1h；4℃10min。立即进行PCR扩增或-20℃保存备用。7.4荧光定量PCR7.4.1荧光PCR反应体系荧光PCR反应体系（25μL,核酸模板5μL）：10×PCR缓冲液，2.5μL；2.5mmol/LMgCL25μL；10mmol/LDNTP0.75μL,10μmol/L上下游引物1μL，5μmol/L探针1μL，0.5μLTaq酶(2U/μL),DNA2μL用DEPC水补足25μL体系。变性95℃5min；42℃，1h；预变性95℃5min；94℃20s、45℃20s、72℃20s,40个循环，于退火结束时收集荧光信号。需配制的荧光PCR预混反应液数量=样品个数+对照个数+1。将各试剂按使用量吸取到微量离心管中，充分混匀，然后再每个PCR光学管中分装25μL。7.4.2反应参数将7.4.1中离心后的PCR管放入实时荧光PCR检测仪内，记录样本摆放顺序。循环参数设置如下：——第一阶段，变性95℃5min；反转录42℃，1h；——第二阶段，预变性95℃5min；DB21/T2537—2015——第三阶段，94℃20s、45℃20s、72℃20s,40个循环，荧光收集设置在第三阶段每次循环的退火延伸时进行。8结果判定8.1结果分析条件设定读取检测结果。阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线的最高点，不同仪器可根据仪器噪音情况进行调整。8.2质控标准8.4.1阴性对照无Ct值并且无扩增曲线。8.4.2阳性对照的Ct值应≤28，并出现特定的扩增曲线。8.4.3如阴性对照和阳性对照条件不满足以上条件，此实验视为无效。8.3结果描述及判定8.4.1阴性判定无Ct值并且无扩增曲线，表明样品中无蓝舌病病毒核酸。8.4.2阳性判定Ct值≤30，且出现特定的扩增曲线，表示样品中存在蓝舌病病毒核酸。DB21/T2537—2015AA附录A(规范性附录)试剂的配制A.1DEPC水去离子水按0.1%加入DEPC，37℃静置过夜，采用(121士2)℃/0.1Mpa,15min高压灭菌后贮存于4℃。A.20.01mol/LPBS先配制A液、B液。A液(0.2mol/LNaH2PO4溶液)：称取一水合磷酸二氢钠(NaH2PO4·H20)27.6g,或二水合磷酸二氢钠(NaH2PO4·2H20)31.2g，溶于蒸馏水中，定容至1L。B液(0.2mol/LNa2HPO4溶液)：称取十二水合磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H20)71.6g，或二水合磷酸氢二钠(Na2HPO4·2H20)35.6g，溶于蒸馏水中，定容至1L。称取17g氯化钠，用适量蒸馏水溶解，量取13mLA液和87mLB液，混合，用蒸馏水定容至2L。采用(121士2)℃/0.1Mpa,15min高压灭菌后贮存于4℃。A.375％乙醇溶液量取75ml无水乙醇溶液，加入双蒸水中，充分混匀，定容至100ml。室温保存。A.450mmol/L氯化钾（50mmol/LKCl）称取3.73g氯化钾，加入双蒸水，充分溶解，定容至1000ml。室温贮存。A.510mmol/LTris-HCl称取0.3028gTris，用双蒸水溶解，然后用HCl调节pH至8.0，最后定容到250mL，室温贮存。A.62.5mmol/LMgCl2称取0.059gMgCl2，用双蒸水溶解，定容到250mL，采用(121士2)℃/0.1Mpa,15min高压灭菌后贮存于4℃。A．7乳糖蛋白胨缓冲液肉汤（BLP）A液的配制:称取4.60g磷酸二氢钠（无水），用双蒸水溶解，充分混匀，最后定容到500mL。B液的配制:称取9.40g磷酸二氢钠（无水），用双蒸水溶解，充分混匀，最后定容到1000mL。工作液的配制：取A液220ml，B液780ml，蛋白胨2.0g，乳糖100g，充分混匀，采用(121士2)℃/0.1Mpa,15min高压灭菌后贮存于4℃。_________________________________