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ICS65.020.30B41DB21辽宁省地方标准DB21/T2534—2015鹿流行性出血病病毒荧光PCR检测方法Methodofthereal-timeRT-PCRforthedetectionofepizootichaemorrhagicdiseaseofdeer2015-10-15发布2015-12-15实施辽宁省质量技术监督局发布DB21/T2534—2015I前言标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准由辽宁出入境检验检疫局提出并归口。本标准起草单位：辽宁出入境检验检疫局。本标准主要起草人：徐凤敏、万超、孙铭英、吴斌。DB21/T2534—2015鹿流行性出血病病毒实时荧光PCR检测方法1范围本标准规定了鹿流行性出血病病毒（EpizooticHaemorrhagicDiseaseVirusofdeer）实时荧光PCR检测方法。本标准适用于鹿流行性出血病病毒的检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法SN/T1193基因检验实验室技术要求3缩略语下列缩略语适用于本文件。Ct值：每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。DEPC：焦碳酸乙二酯（Diethylpyrocarbonate）Taq酶：TaqDNA聚合酶（TaqDNApolymerase）RNA：核糖核酸（RibonucleicAcid）实时荧光PCR：荧光逆转录聚合酶链反应（RealTimeFluorescentQuantitativeReverseTranscriptionPolymeraseChainReaction）4原理采用TaqMan方法，比对鹿流行性出血病病毒基因组S基因的核苷酸序列，设计特异性引物和特异性的荧光双标记探针进行配对。探针5'端标记FAM荧光素为报告荧光基团（用R表示），3'端标记TAMRA荧光素为淬灭荧光基团（用Q表示），它在近距离内能吸收5'端荧光基因发出的荧光信号。PCR反应进入退火阶段时，引物和探针同时与目的基因片段结合，此时探针上R基团发出的荧光信号被Q基因所吸收，仪器检测不到荧光信号；而反应进行到延伸阶段时，Taq酶的5'到3'的外切核酸酶功能将探针降解。这样探针上的R基团游离出来，所发出的荧光不再为Q所吸收而被检测仪所接收。随着PCR反应的循环进行，PCR产物与荧光信号的增长呈现对应关系。5试剂和材料DB21/T2534—2015除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水；所有试剂均用无RNA酶的容器分装。5.1试剂5.1.1DEPC水（见附录A.1）。5.1.20.01mol/LPBS（见附录A.2）5.1.3Trizol裂解液。5.1.4三氯甲烷。5.1.575%乙醇（见附录A.3）。5.1.6异丙醇（-20℃预冷）。5.1.7其他试剂：荧光PCR反应缓冲液：含50mmol/LKCl（见附录A.4）,10mmol/LTris-HCl（pH8.3）（见附录A.5）,2.5mmol/LMgCl2（见附录A.6）。可采用等效商品化试剂。5.1.8dNTPMixture(各10mM)、EX-Taq酶(5U/μL)。5.1.9引物：合成一对特异性引物：上游引物5'-GCGTTGGATATATTGGACAAAGC-3'，下游引物5'-GCATACGAAGCATAAGCAACCTT-3'，TAQMAN探针（FAM）5'-TCAAATCAAACGGGCGCAACTATGG-3'（BGH）均配制成5umol/L，-20℃保存。5.2仪器与耗材5.2.1荧光PCR检测仪。5.2.2高速台式冷冻离心机（最高可达13000r/min）。5.2.3微量移液器：0.5μL～10μL，5μL～20μL，20μL～200μL，100μL～1000μL。5.2.4混匀器。5.2.5冰箱(2℃-8℃)。5.2.6研钵。5.2.7微量可调移液器。5.2.8离心管。5.2.9吸水纸。5.2.10离心管5.2.11微量带芯吸嘴（10μL，100μL，1000μL）。6生物安全要求采样、样品处理及检测过程所涉及的实验操作，应遵守SN/T1193的有关规定。7操作步骤7.1样本的采集与处理7.1.1血样前处理：取2ml全血样品,3000g离心10min，弃沉淀，收集上清。继续进行核酸提取。7.1.2组织样品前处理：取100mg组织样品，剪碎，按1：5的比例加0.01mol/LpH7.6PBS研磨后冻融3次，离心，取上清液，-20℃保存，备用或直接继续进行核酸提取。7.2核酸提取DB21/T2534—2015所有RNA提取器皿用DEPC水浸泡24h，灭菌后方可使用。自上述完成前处理的样品中加入1mlTrizol裂解液，室温放置5min。加入0.2ml三氯甲烷，剧烈振荡15秒，室温放置3min，4℃10000g离心15min。将水相转移到新管中，加入500μl异丙醇(-20℃预冷)，室温放置10min，4℃10000g离心10min，吸取离心后的上清液转移至相应的新管中，上清液约吸取500μl（注意不要吸出中间白色絮状层），轻轻颠倒均匀。于4℃条件下，12000r/min离心15min。取出Eppendorf管，轻轻倒去上清液，加入1ml75%乙醇，颠倒洗涤。于4℃条件下，12000r/min离心15min。取出Eppendorf管，轻轻倒去上清液，倒置于吸水纸上，吸干液体，不同样品应在吸水纸不同地方吸干。每管加入20μl灭菌DEPC水，轻轻混均，溶解管壁上的RNA，2000r/min离心5s，冰上保存备用。提取的RNA应在2h内进行RT-PCR扩增或放置于-70℃冰箱备用。7.3实时荧光PCR反应7.3.1反转录于7.2eppendorf管中依次加入：10×反转录酶缓冲液（200mMTris/HCl,pH8.4,和500mMKCl），2μl；下游引物4μl；dNTPs(10mMeachdATP,dCTP,dGTP,dTTP)，2μl；MgCl2(25mM)2.0µl；DTT（0.1M）2.0µl；AMV反转录酶(200units/µl)，0.5μl，补水至20μl。瞬时离心，95℃10min,45℃40。立即进行PCR扩增或-20℃保存备用。7.3.2荧光PCR反应体系（25μL,核酸模板5μL）:10×PCR缓冲液，2.5μL；2.5mmol/LMgCL25μL；10mmol/LDNTP0.75μL,10μmol/L上下游引物1μL，5μmol/L探针1μL，0.5μLTaq酶(2U/μL),DNA2μL用DEPC水补足25μL体系。需配制的荧光PCR预混反应液数量=样品个数+对照个数+1。将各试剂按使用量吸取到微量离心管中，充分混匀，然后再每个PCR光学管中分装25μL。7.3.3反应参数将7.3.1中离心后的PCR管放入实时荧光PCR检测仪内，记录样本摆放顺序。循环参数设置如下：——第一阶段，反转录95℃10min45℃40min，；——第二阶段，实时PCR95℃15s、50℃30s，72℃30s,40个循环，荧光收集设置在第二阶段每次循环的退火延伸时进行。8结果判定8.1结果分析条件设定读取检测结果。阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线的最高点，不同仪器可根据仪器噪音情况进行调整。8.2质控标准8.2.1阴性对照无Ct值并且无扩增曲线。8.2.2阳性对照的Ct值应≤28，并出现特定的扩增曲线。8.2.3如阴性对照和阳性对照条件不满足以上条件，此实验视为无效。8.3结果描述及判定8.3.1阴性判定DB21/T2534—2015无Ct值并且无扩增曲线，表明样品中无鹿流行性出血病病毒核酸。8.3.2阳性判定Ct值≤30，且出现特定的扩增曲线，表示样品中存在鹿流行性出血病病毒核酸。DB21/T2534—2015AA附录A(规范性附录)试剂的配制A.1DEPC水去离子水按0.1%加入DEPC，37℃静置过夜，采用(121士2)℃/0.1Mpa,15min高压灭菌后贮存于4℃。A.20.01mol/LPBS先配制A液、B液。A液(0.2mol/LNaH2PO4溶液)：称取一水合磷酸二氢钠(NaH2PO4·H20)27.6g,或二水合磷酸二氢钠(NaH2PO4·2H20)31.2g，溶于蒸馏水中，定容至1L。B液(0.2mol/LNa2HPO4溶液)：称取十二水合磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H20)71.6g，或二水合磷酸氢二钠(Na2HPO4·2H20)35.6g，溶于蒸馏水中，定容至1L。称取17g氯化钠，用适量蒸馏水溶解，量取13mLA液和87mLB液，混合，用蒸馏水定容至2L。采用(121士2)℃/0.1Mpa,15min高压灭菌后贮存于4℃。A.375％乙醇溶液量取75ml无水乙醇溶液，加入双蒸水中，充分混匀，定容至100ml。室温保存。A.450mmol/L氯化钾（50mmol/LKCl）称取3.73g氯化钾，加入双蒸水，充分溶解，定容至1000ml。室温贮存。A.510mmol/LTris-HCl称取0.3028gTris，用双蒸水溶解，然后用HCl调节pH至8.0，最后定容到250mL，室温贮存。A.62.5mmol/LMgCl2称取0.059gMgCl2，用双蒸水溶解，定容到250mL，采用(121士2)℃/0.1Mpa,15min高压灭菌后贮存于4℃。_________________________________