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ICS11.220B41DB21辽宁省地方标准DB21/T2469—2015H1N1亚型猪流感病毒荧光RT-PCR检测方法MethodoffluorescentRT-PCRforthedetectionofH1N1swineinfluenzavirus2015-04-30发布2015-06-30实施辽宁省质量技术监督局发布DB21/T2469—2015I前言本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本标准由辽宁省动物疫病预防控制中心提出。本标准由辽宁省畜牧兽医局归口。本标准起草单位：辽宁省动物疫病预防控制中心、辽宁省动物医学研究院。本标准主要起草人：关淼、曹东、兰德松、魏澍、赵凤菊、陈瑶、姚伟、刘坤洋、张雷、杨国丽、魏园园DB21/T2469—20151H1N1亚型猪流感病毒荧光RT-PCR检测方法1范围本标准规定了H1N1亚型猪流感病毒（swineinfluenzavirus，SIV）荧光RT-PCR检测方法的范围、器材和试剂、引物和探针、操作步骤、结果判定和废弃物处理。本标准适用于H1N1亚型猪流感的诊断、监测以及流行病学调查，适用于猪鼻咽棉拭子、肺脏及肺脏淋巴结、鸡胚尿囊培养液以及细胞培养物中H1N1亚型SIVHA和NA基因的检测。本标准中的试验操作应在生物安全Ⅱ级（BSL-2）以上的实验室进行。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。兽医实验室生物安全技术管理规范病原微生物实验室生物安全环境管理办法GB/T27521-2011猪流感病毒核酸RT-PCR检测方法GB/T27536-2011猪流感病毒分离与鉴定方法3缩略语本标准涉及下述缩略语。SIV：猪流感病毒（swineinfluenzavirus）荧光RT-PCR：荧光反转录聚合酶链式反应（realtimefluozescentquantitativereversetranscriptionpolymerasechainreaction）PCR：聚合酶链式反应（polymerasechainreaction）RNA：核糖核酸（ribonucleicacid）DNA：脱氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid）cDNA：互补脱氧核糖核酸（complementaryDNA）HA：血凝素（Hemagglutinin）NA：神经氨酸酶（Neuraminidase）PBS：磷酸缓冲液（配方见附录A）（phosphatebuffersolution）DEPC：焦炭酸二乙酯（diethylpyrocarbonate）4原理SIV是一种RNA病毒。RNA反转录产生的cDNA可作为PCR模板进行扩增。根据H1N1亚型SIV保守基因序列设计一对特异性引物以及一个TaqMan探针，在酶催化下，以母链DNA为模板，体外复制出与母链模板DNA互补的子链DNA。Taqman探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光集团和一个淬灭荧光集团。DB21/T2469—20152在PCR扩增时，探针被酶切降解，使报告荧光集团和淬灭荧光集团分离，就形成可被仪器接受的荧光信号。5器材和试剂5.1器材高速台式冷冻离心机（最高转数12000r/min以上）；冰箱（2～8℃，-20℃和-70℃三种）；混合器；荧光PCR扩增仪；微量移液器；病毒采集管；PCR八联排管或96孔板；吸头（10μL，200μL，1000μL）；无菌注射器；1.5mL离心管、15mL离心管经121（±2）℃高压灭菌15min；研钵或组织匀浆器、眼科剪、眼科镊、剪刀、镊子经160℃干热灭菌2h。5.2试剂PBS：121（±2）℃高压灭菌15min，冷却后，无菌条件下分别加入10000U/mL青霉素、链霉素。Trizol：RNA抽提试剂，外观为粉红色，4～8℃保存。氯仿：4℃预冷。异丙醇：4℃预冷。75%乙醇：用新开封的无水乙醇和DEPC水配制，-20℃保存。DEPC水：1mLDEPC溶于1L去离子水配制成0.1%DEPC水，37℃作用1h，然后121（±2）℃，高压灭菌15min，避光，于密闭容器中2～8℃保存。RNA酶抑制剂（40U/μL）。DNA聚合酶：ExTaqHS（5U/μL）。6引物和探针用于RT-PCR反应的引物浓度为20μmol/L，其序列如下：H1HA基因引物：上游引物F1：5’-CCTCTACCAGAATAATCATAC-3’、下游引物R1：5’-CAGTGTCCAGTAATAATTCA-3’、探针P1：5’-（FAM）TCTGCCTGCTTGTTCTCTGACT（Eclipse）-3’；N1NA基因引物：上游引物F2：5’-CCCATATCGAACATTGATG-3’、下游引物R2：5’-GTCTGTTATTATGCCATTGTA-3’、探针P2：5’-（FAM）CTGTCCTATTGGTGAGGTTCCTTCT（Eclipse）-3’。注：除另有说明，所用试剂均为分析纯；所有试剂均用无RNA酶的容器分装。7操作步骤7.1样品的采集、前处理、存放和运送7.1.1鼻咽棉拭子根据GB/T27521-2011《猪流感病毒核酸RT-PCR检测方法》进行鼻咽棉试子的采集与前处理。7.1.2肺脏及肺脏淋巴结根据GB/T27521-2011《猪流感病毒核酸RT-PCR检测方法》进行肺脏及肺脏淋巴结的采集与前处理。7.1.3鸡胚尿囊液根据GB/T27536-2011《猪流感病毒分离与鉴定方法》进行鸡胚培养及尿囊液的收取，一般一个鸡胚可以收获5～10mL尿囊液，分装入1.5mL离心管中，编号备用。7.1.4细胞培养物DB21/T2469—20153细胞培养物反复冻融3次，转入1.5mL离心管中，编号备用。7.1.5存放与运送用于病毒分离和RT-PCR检测的样品在采集或处理后，在2～8℃条件下保存不超过24h；若需长期保存，放置于-70℃或以下温度保存，避免反复冻融（冻融不超过3次）。采集的样品置于保温器材中加冰袋密封，在6～8h之内运送到实验室。按照《兽医实验室生物安全技术管理规范》进行样品的生物安全标识。7.2实时荧光RT-PCR检测7.2.1RNA提取取n个灭菌的1.5mL离心管，其中n为待检样品数+阳性对照管数+阴性对照管数，对每个离心管进行编号；每管加入750μLTrizol，分别加入被检样品、阳性对照和阴性对照各250μL，颠倒10次混匀，室温静置5min；再加入250μL氯仿，混匀器上振荡混匀15s（也可以用手反复颠倒混匀），4℃12000r/min离心15min；取与第一步中相同数量灭菌的1.5mL离心管，加入500μL异丙醇(4℃预冷)；取第三步中离心后的上清液约500μL转移至已加入氯仿的相应的管中，颠倒混匀，室温静置15min，4℃12000r/min离心15min，弃上清，倒置于吸水纸上，沾干液体；加入1mL75%乙醇，4℃12000r/min离心10min，弃上清，倒置于吸水纸上，沾干液体；4000r/min离心10s，用微量加样器小心将残余液体吸干，室温干燥3～10min；加入18μL经DEPC处理的水和2μLRNA酶抑制剂，轻柔混匀，溶解管壁上的RNA，冰上保存备用。提取的RNA在2h内进行RT-PCR扩增；于-70℃冰箱长期保存。7.2.2配置扩增体系配制HA基因扩增反应液，设实时荧光PCR反应数为n，其中n为待检样品数+阳性管数+阴性管数，每个样本检测反应体系按下列组份配制，向每个荧光PCR管或孔中分装23μL的反应体系。NA基因扩增反应液配制方法同HA基因。反应体系：2×OneStepRT-PCRBufferⅢ12.5μLEXTaqHS0.5μLPrimeScriptRTenzymeMixⅡ0.5μL上游引物F0.25μL下游引物R0.25μL探针P0.25μLROXReferenceDyeorDyeⅡ0.5μLRNaseFreedH2O8.25μL7.2.3加样在各设定的荧光PCR管中加入7.2.1中制备的2μLRNA模板溶液。盖紧管盖，除气泡，500r/min离心30s。7.2.4荧光RT-PCR扩增7.2.4.1将7.2.3中离心后的PCR管放入荧光PCR扩增仪内，记录样品摆放次序。7.2.4.2HA和NA基因扩增反应条件均为：第一阶段：42℃5min，95℃10sec；第二阶段：95℃5sec，60℃34sec，40个循环，60℃时设置采集荧光信号。荧光集团设定：检测荧光ReportDyeDB21/T2469—20154设定为FAM，淬灭荧光QuenchDye设定为None，校准荧光ReferenceDye设定为Rox。试验结束后，根据收集的荧光曲线和Ct值判定结果。8结果判定8.1质控标准8.1.1阴性对照无Ct值，且无扩增曲线。8.1.2阳性对照Ct值应小于28.0，并出现典型的扩增曲线。8.1.3当8.2.1和8.2.2都成立时，此次试验有效；否则，此次试验视为无效。8.2结果描述及判定8.2.1H1HA基因无Ct值并且无扩增曲线，判为阴性；Ct值小于35.0，且出现典型的扩增曲线，判为阳性。8.2.2N1NA基因无Ct值并且无扩增曲线，判为阴性；Ct值小于35.0，且出现典型的扩增曲线，判为阳性。9废弃物处理按照《兽医实验室生物安全技术管理规范》中相关规定执行。_________________________________