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ICS65.020.01B04DB21辽宁省地方标准DB21/T2396—2015水稻品种抗稻瘟病基因检测PCR法2015-05-18发布2015-07-18实施辽宁省质量技术监督局发布DB21/T2396—2015I前言本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准由辽宁省农业科学院提出。本标准由辽宁省农村经济委员会归口。本标准由辽宁省农业科学院创新中心负责起草。本标准主要起草人：陆晓春、郑文静、丛玲、赵家铭、王妍、张丽霞、白春明、王春语、朱振兴、马丽、李丹、王平、李金红等。本标准由辽宁省农业科学院创新中心负责解释。DB21/T2396—20151水稻品种抗稻瘟病基因检测PCR法1范围本标准规定了检测水稻品种抗稻瘟病基因的PCR检测法，包括原理、仪器设备、试剂和材料、防污染措施、实验步骤及结果分析。本标准适用于水稻品种中抗稻瘟病基因pita、pid2、pid3、pik、pikp、pikm、piks、pi21、pi36、pi37和pi5的检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T19495.2转基因产品检测实验室技术要求农业部1485号公告--4—2010转基因植物及其产品成分检测DNA提取和纯化3术语及缩略语下列术语及缩略语适用于本标准3.1正向引物：处于DNA双链上游的引物，简称F引物。3.2反向引物：处于DNA双链下游的引物，简称R引物。3.3内参引物：在聚合作用起始时，可以刺激合成另一种大分子，并与反应物以共价键形式连接的序列。3.4DNA:Deoxyribonucleicacid,脱氧核糖核酸。3.5PrimeSTARHSDNAPolymerase:高保真DNA聚合酶。3.6PrimeSTARBuffer（5×）:5×PCR反应液。3.7dNTPMixture（10mM）:单核苷酸混合液（10mM）。3.8PCR:Polymerasechainreaction。3.9TAE：Tris-Cl、冰醋酸、EDTA缓冲液。DB21/T2396—201523.10Goldenview：核酸染料，替代溴化乙锭。3.11DNAMarker：标准分子量的核酸标记。3.12bp:Basepair,碱基对。3.13Tris：tris(hydroxymethyl)aminomethane，三羟甲基氨基甲烷。4原理根据水稻抗病基因保守区序列设计特异性引物，提取不同水稻品种的DNA，对试样进行PCR扩增，依据是否扩增获得预期大小的DNA片段及特定的序列来判断样品是否携带该抗病基因。5仪器设备5.1台式离心机。5.2PCR仪。5.3凝胶成像系统。5.4琼脂糖电泳槽及电泳仪等电泳装置。5.5恒温水浴锅。5.6分析天平：感量0.1g、0.01g和0.1mg。5.7具盖塑料离心管：2mL，0.2mL。5.8研钵、研杵。5.9移液枪和吸头：1000µL,200µL,10µL。5.10其它相关仪器设备6试剂和材料6.1供试水稻叶片或种子。6.2DNA提取试剂盒。6.3PrimeSTARHSDNAPolymerase。6.4PrimeSTARBuffer（5×）。6.5dNTPMixture（10mM）。6.6DNAMarker：可以清楚地区分100bp～1000bp的DNA片段。6.750×TAE缓冲液，使用时稀释50倍。DB21/T2396—201536.8加样缓冲液。6.9引物见附录A。除非另有说明，仅使用分析纯试剂和重蒸馏水或符合GB/T6682规定的一级水。7防污染措施检测过程中防止污染的措施按照GB/T19495.2中的规定执行。8实验步骤8.1水稻DNA提取按农业部1485号公告--4—2010的规定执行。8.2PCR反应8.2.1将试样DNA、PrimeSTARBuffer（5×）、dNTPMixture、正向引物及反向引物及ddH2O置于冰上融化。8.2.2在0.2mL加盖无菌离心管中，按先后顺序加入：PrimeSTARBuffer（5×）6μLdNTPMixture(2.5mM)2.4μL正向引物及反向引物(100nM)0.2μL(终浓度:0.2μM~0.3μM)，试样DNA1μL（20～100ng）ddH2O20.1μLPrimeSTARHSDNAPolymerase(2.5U/μL)0.3μL用移液枪抽打混匀，盖上盖子短暂离心，置于冰上待用。8.2.3将离心管置于PCR仪中，反应程序为：95℃预变性5min，95℃变性30s，55℃～61℃退火30s，，72℃延伸30s～60s（每对引物的退火温度及延伸时间参见附录A），29个循环，72℃总延伸5min，4℃保存。8.3PCR产物电泳8.3.1用200mL玻璃烧杯称取琼脂糖0.5g，加入1×TAE缓冲液50mL。8.3.2杯口用锡箔纸盖好，置微波炉中加热至琼脂糖完全溶解。8.3.3琼脂糖冷却至50℃左右时加入2.5μLGoldenview，混匀，迅速将胶倒至模具中，放置上样梳。8.3.4待胶完全凝固后，拔下上样梳，置于盛有1×TAE缓冲液的电泳槽中。8.3.5吸取5μLPCR反应液，与1μL加样缓冲液混匀，上样，130v电泳0.5h～1.0h。8.3.6电泳结束后，取下琼脂糖胶，利用凝胶成像系统观察电泳条带大小，并照相。8.4PCR产物测序DB21/T2396—20154将25μL的PCR产物提交至DNA测序技术机构，测序。9结果分析9.1判定原则9.1.1模板质量的检测所有参试品种的DNA，需用水稻内参引物（Primer9）检测，以确定DNA模板的浓度及纯度适宜,如用水稻内参引物（Primer9）扩增时无特异性PCR产物，则需重新提取试样DNA。9.1.2结果判定原则鉴定水稻品种中是否携带抗稻瘟病基因时，如不能扩增出特定长度的PCR产物，则可判断试样中不含有相应的抗病基因；如可扩增出特定长度的PCR产物，则需结合电泳结果和测序结果共同分析。9.2Pita9.2.1电泳结果分析用附录A中Primer1扩增，如该品种携带Pita抗病基因，则其PCR产物应为467bp，电泳图中其产物片段应处于DNAMarker的400bp～500bp间；反之，如无PCR产物或PCR片段长度与467bp差距较大则认为参试品种不携带Pita抗病基因。9.2.2测序结果分析PCR产物的序列与附录B所示序列seq-1分析在431bp～433bp处，如碱基序列为GCT则该品种所含抗病基因则为Pita的抗病等位基因；反之，如该品种在431bp～433bp处测得的序列为TCT或其它序列，则认为参试品种含有Pita的感病等位基因。9.3Pid29.3.1电泳结果分析用附录A中Primer2扩增，如该品种携带Pid2抗病基因，则其PCR产物应为496bp，电泳图中其产物片段应处于DNAMarker500bp左右；反之，如无PCR产物或产物片段长度与496bp差距较大则认为参试品种不携带Pid2抗病基因。9.3.2测序结果分析PCR产物的序列与附录B所示序列seq-2分析在263bp～265bp处，如碱基序列为ATA则该品种所含抗病基因则为Pid2的抗病等位基因；反之，如为ATG或其它序列，则认为参试品种含有Pid2的感病等位基因。9.4Pid39.4.1电泳结果分析用附录A中Primer3扩增，如该品种携带Pid3抗病基因，则其PCR产物应为550bp，电泳图中其产物片段应处于DNAMarker500bp～600bp间；反之，如无PCR产物或产物片段长度与550bp差距较大则认为参试品种不携带Pid3抗病基因。DB21/T2396—201559.4.2测序结果分析PCR产物的序列与附录B所示序列seq-3分析在232bp～234bp处，如碱基序列为CAG则该品种所含抗病基因为Pid3的抗病等位基因；反之，如为TAG或其它序列，则认为参试品种含有Pid3的感病等位基因。9.5Pik/Pikp/Pikm/Piks9.5.1电泳结果分析用Primer4扩增，如该品种携带Pik/Pikp/Pikm/Piks抗病基因，则其PCR产物应为992bp，电泳图中其产物片段应处于DNAMarker1000bp左右；反之，如无PCR产物或产物片段长度与1000bp差距较大则认为参试品种不携带Pik/Pikp/Pikm/Piks抗病基因。9.5.2测序结果分析PCR产物的序列与附录B所示序列seq-4比对，如在685bp～687bp处碱基序列为GAG且在754bp～756bp处为CCT，则该品种所含抗病基因为则为Piks的抗病等位基因；如在685bp～687bp处碱基序列为CAG且在754bp～756bp处为CCT，则该品种所含抗病基因为Pikm的抗病等位基因；如在685bp～bp687处碱基序列为AAG且在754bp～756bp处为CAT，则该品种所含抗病基因为Pik的抗病等位基因；如在685bp～687bp处碱基序列为AAG且在754bp～756bp处为GAT，则该品种所含抗病基因为Pikp的抗病等位基因；反之，待检品种在上述区域序列与几种等位基因均不符，则认为参试品种不含有Pik及其它几个抗病等位基因。9.6Pi219.6.1电泳结果分析用Primer5扩增，如该品种携带Pi21抗病基因，则其PCR产物应为633bp，反之，如无PCR产物或产物片段长度与633bp差距较大则认为参试品种不携带Pi21抗病基因。9.6.2测序结果分析PCR产物的序列与附录B所示序列seq-5比对，如在138后及在321后分别有ctgccgcagccgccgccgccg21个及tgcaagccggaggagccgccgaagccgccgccggagaagccgccgccg及48个碱基的缺失（即去除前后引物结合的位置，参试品种序列应与seq-5所示序列一致），则该品种所含抗病基因为Pi21的抗病等位基因；反之，若待检品种不存在上述特定序列的缺失，则认为参试品种不含有Pi21抗病基因。9.7Pi369.7.1电泳结果分析用Primer6扩增，如该品种携带Pi36抗病基因，则其PCR产物应为452bp，电泳图中其产物片段应处于DNAMarker400bp～500bp间；反之，如无PCR产物或产物片段长度与452bp差距较大则认为参试品种不携带Pi36抗病基因。9.7.2测序结果分析PCR产物的序列与附录B所示序列seq-6分析在271bp～273bp处，如碱基序列为AGT则该品种所含抗病基因则为Pi36的抗病等位基因；反之，如为AAT或其它序列，则认为参试品种含有Pi36的DB21/T2396—20156感病等位基因。9.8Pi379.8.1电泳结果分析用Primer7扩增，如该品种携带Pi37抗病基因，则其PCR产物应为600bp，电泳图中其产物片段应处于DNAMarker600bp附近；反之，如无PCR产物或产物片段长度与600bp差距较大则认为参试品种不携带Pi37抗病基因。9.8.2测序结果分析PCR产物的序列与附录B所示序列seq-7比对，如在295bp～297bp处碱基序列为GTA，且在319bp～321bp处碱基序列为ATG，则该品种所含抗病基因则为Pi37的抗病等位基因；如在295bp～297bp处碱基序列为GCA或其它序列，以及在319bp～321bp处碱基序列为ATC、ATA或ATT或其它序列，则认为参试品种含有Pi37的感病等位基因。9.9Pi5用Primer8扩增，如该品种携带Pi5抗病基因，则其PCR产物应为1105bp；反之，如无PCR产物或产物片段长度与1105bp差距较大则认为参试品种不携带Pi5抗病基因。DB21/T2396—20157AA附录A（规范性附录）用于扩增抗稻瘟病基因的引物抗病基因引物序列(5′-3′)退火温度(℃)延伸时间(s)FACTTCATGTTTGTCTGTACAGCAPitaPrimer1RTC