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ICS65.020.01B04DB21辽宁省地方标准DB21/T2395—2015稻瘟病菌无毒基因检测PCR法2015-05-18发布2015-07-18实施辽宁省质量技术监督局发布DB21/T2395—2015I前言本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准由辽宁省农业科学院提出。本标准由辽宁省农村经济委员会归口。本标准由辽宁省农业科学院创新中心负责起草。本标准主要起草人：郑文静、陆晓春、王世维、赵家铭、马丽、丛玲、张丽霞、白春明、王春语、王妍、朱振兴、李丹、王平、李金红等。本标准由辽宁省农业科学院创新中心负责解释。DB21/T2395—20151稻瘟病菌无毒基因检测PCR法1范围本标准规定了检测稻瘟病菌（Magnaporthegrisea）无毒基因的检测方法，包括原理、仪器设备、试剂及样品、防污染措施、实验步骤及结果分析。本标准适用于稻瘟病菌中无毒基因AVR1-CO39、AVR-Pia、AVR-Pii、AVR-Pik、AVR-Pita和AVR-piz-t的检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T19495.2转基因产品检测实验室技术要求3术语及缩略语下列术语及缩略语适用于本标准3.1正向引物：处于DNA双链上游的引物，简称F引物。3.2反向引物：处于DNA双链下游的引物，简称R引物。3.3内参引物：在聚合作用起始时，可以刺激合成另一种大分子，并与反应物以共价键形式连接的序列。3.4DNA：DeoxyribonucleosidetripHospHate，脱氧核糖核酸。3.5TE：Tris-Cl、EDTA缓冲液。3.6TBE：Tris-Cl、硼酸、EDTA缓冲液。3.7PrimeSTARHSDNAPolymerase：高保真DNA聚合酶。3.8PrimeSTARBuffer（5×）:5×PCR反应液。3.9dNTP：DeoxyribonucleosidetripHospHate，脱氧核苷三磷酸。3.10PCR：Polymerasechainreaction。DB21/T2395—201523.11bp：Basepair，碱基对。3.12Goldenview：核酸染料，替代溴化乙锭。3.13DNAMarker：标准分子量的核酸标记。3.14bp:Basepair,碱基对。3.15Tris：tris(hydroxymethyl)aminomethane，三羟甲基氨基甲烷。3.16EDTA：disodiumethytenediaminetetracetace2H2O4原理根据稻瘟病菌无毒基因保守区序列设计特异性引物，提取稻瘟病菌DNA，对试样进行PCR扩增，依据是否扩增获得预期的DNA片段大小及特定的序列来判断样品是否携带该无毒基因。5仪器设备5.1分析天平：感量0.1g,0.01g和0.1mg。5.2瓷质研钵、研杵。5.3具盖塑料离心管：2mL,1.5ml，0.2mL。5.4移液枪和吸头：1000µL,200µL,10µL。5.5水浴锅。5.6台式离心机。5.7NanoDrop2000c核酸浓度测定仪。5.8PCR热循环仪。5.9琼脂糖电泳槽及电泳仪。5.10凝胶成像系统5.11其它相关仪器设备。6试剂及样品6.110%CTAB6.25MNacl6.30.5MEDTA(PH8.0)6.41MTris,pH8.06.5DNA提取缓冲液。DB21/T2395—201536.61×TE缓冲液。6.75×TBE缓冲液。6.8氯仿:异戊醇（24:1）。6.9异丙醇。6.1075%乙醇。6.11Goldenview（代替溴化乙锭）。6.12干燥的稻瘟病菌丝0.05g～0.1g。6.13引物见附录A除非另有说明，仅使用分析纯试剂和重蒸馏水或符合GB/T6682规定的一级水。7防污染措施检测过程中防止污染的措施按照GB/T19495.2中的规定执行。8实验步骤8.1试剂配制8.1.110%CTAB：分别称取CTAB10g和NaCl4.1g，加入100mL重蒸馏水，65℃充分溶解。8.1.25MNacl：称取Nacl73.05g，加入200mL重蒸馏水溶解，定容体积到250mL,平均分装。8.1.30.5MEDTA(PH8.0)：称取EDTA46.53g，加入200mL重蒸馏水，调整pH到8.0（约需NaOH5.5g），定容到250mL。8.1.41MTris,pH8.0：称取Tris-base121.9g，加入800mL重蒸馏水，将溶液冷却到室温，调整pH到8.0（约需浓HCl50mL）并定容至1000mL。8.1.5DNA提取缓冲液：10mL1MTrispH8.0，20mL5MNaCl，4mL0.5MEDTA及20mL10%CTAB混合，加水46mL定容到100mL（现用现配）。8.1.61×TE缓冲液：1mL1MTris（pH8.0），0.2mL0.5MEDTA（pH8.0），加水定容至100mL。8.1.75×TBE缓冲液：称取Tris27g及硼酸13.75g，分别加水溶解，再加入10mLEDTA（0.5MPH8.0），定容至1000mL，使用时稀释10倍。8.2稻瘟病菌菌丝DNA提取8.2.1取单孢培养后烘干的菌丝0.1g于研钵中加入液氮用研杵研磨，菌粉转入2mL灭菌离心管，并加入65℃预热的DNA提取缓冲液700μL，盖盖混匀，置于水浴锅内65℃温浴1h（期间间隔15min摇动混匀，使DNA提取缓冲液与菌丝充分混合，保证菌丝DNA的提取效率）。DB21/T2395—201548.2.212000r/min离心10min，取上清液600μL置于新的2mL离心管，加入等体积氯仿／异戊醇（24﹕1）振荡抽提5min~10min，12000r/min离心10min。8.2.3缓慢吸取上清液500μL置于新的1.5mL离心管，加入等体积氯仿／异戊醇（24﹕1）振荡抽提5min~10min，12000r/min离心10min。8.2.4缓慢吸取上清液300μL于新的1.5mL离心管，加入900μL-20℃预冷的无水乙醇，-20℃放置10min，12000r/min离心10min。8.2.5倒掉上清液，用75%乙醇洗涤沉淀3次，干燥后加入100μL1×TE缓冲液溶解，利用NanoDrop2000c测定菌株DNA浓度，并用1×TE缓冲液稀释至100ng/μL，-20℃保存备用。8.3PCR反应8.3.1将DNA、PrimeSTARBuffer（5×）、dNTPMixture、正向引物（F）及反向引物（R）及重蒸馏水置于冰上融化。8.3.2在0.2mL加盖无菌离心管中，按先后顺序加入PrimeSTARBuffer（5×）6μLdNTPMixture(2.5mM)2.4μL正向引物及反向引物(100nM)0.2μL(终浓度:0.2μM~0.3μM)试样DNA1μL（20-100ng）重蒸馏水20.1μLPrimeSTARHSDNAPolymerase(2.5U/μL)0.3μL混合后用移液枪抽打混匀，封盖后短暂离心待用。8.3.3将离心管置于PCR仪中，反应程序为：95℃预变性5min，95℃变性30s，55℃～61℃退火30s，，72℃延伸30s～60s（每对引物的退火温度及延伸时间参见附录A），29个循环，72℃总延伸5min，4℃保存。8.4电泳8.3.1用200mL玻璃烧杯称取琼脂糖0.5g，加入0.5×TBE缓冲液50mL。8.3.2杯口用锡箔纸盖好封严，置微波炉中加热至琼脂糖完全溶解。8.3.3待琼脂糖温度达到50℃左右时加入2.5μLGoldenview（代替溴化乙锭），混匀，迅速将胶倒至模具中，放上样梳。8.3.4约20min待胶完全凝固后，拔下上样梳，置于盛有0.5×TBE缓冲液的电泳槽中。8.3.5吸取5μLPCR反应液，上样130v，电泳0.5h～1.0h。8.3.6电泳结束后，取下琼脂糖凝胶，利用凝胶成像系统观察电泳条带大小，照相。8.4PCR产物测序将25μL的PCR产物提交至中美泰和（北京）生物技术公司，纯化PCR产物，测序。DB21/T2395—201559结果分析9.1判定原则鉴定稻瘟病菌中是否携带抗稻瘟病基因时，如不能获得特定长度的PCR产物，则可判断试样中不含有相应的无毒基因；如可扩增出特定长度的PCR产物，则需结合电泳结果和测序结果共同分析。所有无毒基因的扩增子序列应与附录B的seq1-18中阴影部分序列相比对。9.2Avr1-CO39以参试菌株DNA为模板，利用附录A中Primer1扩增，如扩增子长600bp，且序列如与附录B中seq1阴影部分序列（外显子区）相符，表明该菌株携带Avr1-CO39，反之，如果无特异性扩增产物或测序结果与附录B中seq1阴影部分序列不符则表明该菌株不携带此无毒基因。9.3Avr-Pia以参试菌株DNA为模板，利用附录A中Primer2扩增，如扩增子长464bp，且序列如与附录B中seq2阴影部分序列相符，表明该菌株携带Avr-Pia，反之，如果无特异性扩增产物或测序结果与附录B中seq2阴影部分序列不符则表明该菌株不携带此无毒基因。9.4Avr-Pii以参试菌株DNA为模板，利用附录A中Primer3扩增，如扩增子长373bp，且序列如与附录B中seq3阴影部分序列相符，表明该菌株携带Avr-Pii；反之，如果无特异性扩增产物或测序结果与附录B中seq3阴影部分序列不符则表明该菌株不携带此无毒基因。9.5Avr—Pik以参试菌株DNA为模板，利用附录A中Primer4扩增，如扩增子长503bp，且序列如与附录B中seq4阴影部分序列相符，表明该菌株携带Avr-PiK-D；如阴影部分序列如与seq5相符，表明该菌株携带Avr-PiK-B；如阴影部分序列如与seq6相符，表明该菌株携带Avr-PiK-E；如阴影部分序列如与seq7相符，表明该菌株携带Avr-PiK-F；如阴影部分序列如与seq8相符，表明该菌株携带Avr-PiK-G；如无特异性PCR扩增产物或编码区序列（阴影部分）与seq4-8均不符的表明该菌株不携带Avr-Pik或已知的等位基因类型。9.6Avr-PitaAvr-Pita具4段外显子，利用Primer5和Primer6扩增，再将两端产物序列相拼接，若阴影部分序列如与seq9相符，表明该菌株携带Avr-Pita；如阴影部分序列如与seq10相符，表明该菌株携带Avr-Pita-Ⅰ；如阴影部分序列如与seq11相符，表明该菌株携带Avr-Pita-Ⅱ；如阴影部分序列如与seq12相符，表明该菌株携带Avr-Pita-Ⅲ；如阴影部分序列如与seq13相符，表明该菌株携带Avr-Pita-Ⅳ；如阴影部分序列如与seq14相符，表明该菌株携带Avr-Pita-Ⅴ；如阴影部分序列如与seq15相符，表明该菌株携带Avr-1-Pita-Ⅵ；如阴影部分序列如与seq16相符，表明该菌株携带Avr-Pita-Ⅶ；若无特异性PCR扩增产物或编码区序列（阴影部分）与seq9-16均不符的表明该菌株不携带Avr-Pita或已知的等位基因类型。9.6Avr-Piz-tDB21/T2395—20156以参试菌株DNA为模板，利用附录A中Primer7扩增，如扩增子长505bp，且编码区序列如与seq16相符，表明该菌株携带Avr-Piz-t-A；若编码区序列（阴影部分）与seq17相符，表明该菌株携带Avr-Piz-t-B；如无特异性PCR扩增产物或编码区序列与seq17-18均不符的表明该菌株不携带Avr-Piz-t或已知的等位基因类型。DB21/T2395—20157AA附录A（规范性附录）用于扩增无毒基因的引物引物无毒基因引物序列(5′-3′)延伸时间(s)退火温度(℃)FCTCTGAACAACTAAGCAACAPrimer1Avr1-CO39RCAACCTGGACTCT