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ICS71.040.40B04DB21辽宁省地方标准DB21/T2410—2015养殖水体中氯霉素残留量的测定高效液相色谱串联质谱法DeterminationofchloramphenicolresiduesinaquaculturewaterbyHPLC-MS/MSmethod2015-01-22发布2015-03-22实施辽宁省质量技术监督局发布DB21/T2410—2015I前言本标准按照GB/T1.1-2009标准化工作导则起草。本标准由大连市水产技术推广总站提出。本标准由辽宁省海洋与渔业厅归口。本标准起草单位：大连市水产技术推广总站。本标准主要起草人：张秀妍、王骏、丁勇、刘彤、马琳、郝佳。DB21/T2410—20151养殖水体中氯霉素残留量的测定高效液相色谱串联质谱法1范围本标准规定了养殖水体中氯霉素残留量的测定原理、试剂制备、测定步骤和结果计算。本标准适用于渔业生产养殖水体中氯霉素残留量的测定。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法3原理样品中的氯霉素用乙酸乙酯液液萃取，反相色谱柱分离，质谱检测器检测，内标法定量。4试剂4.1乙酸乙酯：色谱纯4.2甲醇：色谱纯4.3甲醇水溶液[1+1]:100mL甲醇加入100mL水中，超声混匀。4.4标准品：氯霉素，纯度≥99.5%。4.5氘代氯霉素内标标准溶液：100μg/mL。4.6标准溶液4.6.1氯霉素标准储备溶液[1.0mg/mL]：准确称取25.00mg的氯霉素标准品，用甲醇定容到25.00mL，配制成1.0mg/mL的标准储备溶液，该溶液于-18℃避光保存，有效期为6个月。4.6.2氯霉素标准中间溶液[1μg/mL]:准确量取100μL氯霉素标准储备溶液（4.6.1）于100mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度。该溶液于-18℃避光保存，有效期为2周～3周。4.6.3氯霉素标准使用溶液[50ng/mL]:准确量取0.5mL氯霉素标准中间溶液（4.6.2）于10mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度。该溶液于4℃保存，有效期为1周。DB21/T2410—201524.6.4氯霉素标准使用溶液[10ng/mL]:准确量取100μL氯霉素标准中间溶液（4.6.2）于10mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度。该溶液于4℃保存，有效期为1周。4.6.5氘代氯霉素标准中间溶液[1μg/mL]：准确量取1mL氘代氯霉素标准溶液（100μg/mL）于100mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度。该溶液于-18℃避光保存，有效期为2～3周。4.6.6氘代氯霉素标准使用溶液[100ng/mL]：准确量取10mL氘代氯霉素标准中间溶液（4.6.5）于100mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度。该溶液于4℃避光保存，有效期为1周。5仪器和设备5.1高效液相色谱-串联质谱联用仪。5.2电子天平：感量0.01mg。5.3溶剂过滤器。5.4混合纤维素酯水性滤膜：孔径0.45μm。5.5旋转蒸发仪。5.6旋涡振荡器。5.7超声振荡器。6测定步骤6.1样品处理6.1.1将水样经混合纤维素酯滤膜过滤。6.1.2量取过滤的水样250.0mL，置于500mL分液漏斗中。向分液漏斗中加入50.0µL氘代氯霉素标准使用溶液（4.6.6），振摇混匀。6.1.3加入50mL乙酸乙酯，剧烈振摇3min，静置分层。将下层水样放入烧杯中。用滤纸卷吸干锥形分液漏斗管颈内水分，乙酸乙酯萃取液放入125mL鸡心瓶中。6.1.4将萃取过的烧杯中的水样倒回原分液漏斗，重复萃取步骤（6.1.2）一次。合并乙酸乙酯萃取液于上述125mL鸡心瓶中，45℃±2℃水浴中减压浓缩至近干。6.1.5向鸡心瓶中加入1.0mL甲醇水溶液（4.3），涡旋振荡1min、超声振荡1min，样液经0.22µm针孔式有机相滤膜过滤后供高效液相色谱-串联质谱联用仪测定。6.2空白试验量取250.0mL纯水，按样品处理步骤（6.1）进行。6.3测定6.3.1色谱条件6.3.1.1色谱柱：C18柱，100mm×3.0mm（内径），粒度1.8µm。DB21/T2410—201536.3.1.2流动相：甲醇:水为60:40（V/V）。6.3.1.3流速：0.3mL/min。6.3.1.4柱温：35℃。6.3.1.5进样量：20µL。6.3.2质谱条件6.3.2.1离子源：电喷雾ESI源。6.3.2.2扫描方式：负离子扫描。6.3.2.3检测方式：多重反应监测（MRM）。6.3.2.4雾化气压力：0.28MPa。6.3.2.5雾化气温度：350℃。6.3.2.6雾化气、干燥气为高纯氮气，气体流量：10L/min。6.3.2.7碰撞气为高纯氮气，气体压力：0.15MPa。6.3.2.8监测离子对：氯霉素m/z321/257、321/152；氘代氯霉素m/z326/157。6.4标准曲线的配制分别准确移取10ng/mL氯霉素标准使用溶液（4.6.4）0.00mL、0.50mL、1.00mL和50ng/mL氯霉素标准使用溶液（4.6.3）0.25mL、0.50mL、1.00mL于6个10.00mL容量瓶中，每个容量瓶中加入0.5mL氘代氯霉素标准使用溶液(4.6.6)，用流动相（6.3.1.2）定容至10mL。配制成的标准系列溶液浓度分别为0.00ng/mL、0.50ng/mL、1.00ng/mL、1.25ng/mL、2.50ng/mL和5.00ng/mL，每毫升该溶液含有氘代氯霉素5.0ng。将此标准系列溶液按6.3的仪器条件测定，氯霉素以氘代氯霉素为内标物，通过仪器工作站制定内标法标准曲线。6.5定性依据在相同测定条件下，待测组分与标准物质保留时间相对标准偏差在±5%以内，离子的相对丰度与浓度相当的校正标准的相对丰度一致，可判断为阳性样品。6.6定量测定将样品制备液按6.3测定，通过仪器工作站计算制备液中氯霉素的浓度。在上述条件下，标准溶液中氯霉素、氘代氯霉素的参考保留时间分别为2.450min、2.476min，标准溶液的色谱图及质谱图参见附录A。7结果计算7.1制备液中氯霉素的浓度Ci由仪器工作站依据内标法标准曲线自动计算。7.2样品中氯霉素的含量按式（1）计算。计算结果需扣除空白值。DB21/T2410—2015421VVCiXi×=......................................(1)式中：Xi—样品中氯霉素的含量，单位为微克每升（µg/L）；Ci—制备液中氯霉素的浓度，单位为微克每升（µg/L）；V1—最终定容体积，单位为毫升（mL）；V2—样品体积，单位为毫升（mL）。8检出限氯霉素的检出限为2ng/L，定量限为4ng/L。9线性范围氯霉素的线性范围为0.5µg/L～5.0µg/L。10回收率氯霉素添加浓度为2ng/L～20ng/L时，回收率为80%～110%。11精密度本方法的批内相对标准偏差小于10%，批间相对标准偏差小于15%。DB21/T2410—20155AA附录A（资料性附录）氯霉素和氘代氯霉素标准溶液的色谱图和质谱图图A.1氯霉素和氘代氯霉素标准溶液的色谱图图A.2氯霉素标准溶液的质谱图图A.3氘代氯霉素标准溶液的质谱图_________________________________