搜索
ICS67.120B45备案号：44981-2015DB22吉林省地方标准DB22/T2260—2015鹿鞭鉴定方法PCR法IdentificationofSikaDeerandWapitiPizzles----PolymeraseChainReactionMethod2015-02-01发布2015-03-01实施吉林省质量技术监督局发布本标准仅供内部使用不得翻印本标准仅供内部使用不得翻印本标准仅供内部使用不得翻印本标准仅供内部使用不得翻印DB22/T2260—2015I前言本标准按照GB/T1.1-2009和GB/T20001.4-2001给出的规则起草。本标准由吉林省畜牧业管理局提出并归口。本标准起草单位：中国农业科学院特产研究所。本标准主要起草人：邢秀梅、吴琼、杨福合、苏伟林、邵元臣、查代明、荣敏、刘华淼、徐佳萍、杨颖、涂剑锋、张铁涛。本标准仅供内部使用不得翻印本标准仅供内部使用不得翻印本标准仅供内部使用不得翻印本标准仅供内部使用不得翻印DB22/T2260—20151鹿鞭鉴定方法PCR法1范围本标准规定了梅花鹿鞭、马鹿鞭（塔河马鹿除外）的PCR鉴定方法。本标准适用于梅花鹿鞭、马鹿鞭（塔河马鹿除外）的真伪鉴定。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法WS/T230-2002临床诊断中聚合酶链反应（PCR）技术的应用3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1鹿鞭pizzle梅花鹿、马鹿的外生殖器，包括阴茎及睾丸。4原理针对梅花鹿、马鹿线粒体DNA（mtDNA）的D-loop区特异性基因序列设计引物，应用聚合酶链反应（PCR）技术扩增特异性DNA片段，根据是否扩增出特异性片段对鹿鞭进行鉴定。5试剂和材料除非另有说明，所有的化学试剂均为分析纯。实验用水规格应符合GB/T6882中二级水的规定。5.1引物上游引物：5’-CAAAGCACGTGATATAACCTTATG-3’下游引物：5’-ATCTAGTGCTCGAATTAATGGTAC-3’5.2试剂5.2.1氯化钠（NaCl），CAS号7647-14-5。5.2.2氯化镁（MgCl2·6H2O），CAS号7791-18-6。5.2.3氢氧化钠（NaOH），CAS号1310-73-2。本标准仅供内部使用不得翻印本标准仅供内部使用不得翻印DB22/T2260—201525.2.4琼脂糖，CAS号9012-36-6。5.2.5三羟甲基氨基甲烷（Tris），CAS号77-86-1。5.2.6十二烷基磺酸钠（SDS），CAS号2386-53-0。5.2.7乙二胺四乙酸二钠盐（Na2EDTA），CAS号15708-41-5。5.2.8盐酸（HCl），CAS号7647-01-0。5.2.9三氯甲烷（氯仿），CAS号67-66-3。5.2.10冰乙酸，CAS号64-19-7。5.2.11无水乙醇，CAS号64-17-5。5.2.12Tris饱和酚，CAS号108-95-2。5.2.13TritonX-100，CAS号9036-19-5。5.2.1475%乙醇。5.2.15酚﹕氯仿混合液（体积比1﹕1）：Tris饱和酚、氯仿等体积混合，置于棕色瓶中，4℃保存。5.2.16dNTP溶液（市售）：含dATP、dTTP、dCTP、dGTP，各2.5mmol/L。5.2.1710×PCRBuffer缓冲液（不含氯化镁）（市售）：100mmol/LKCl，160mmol/L(NH4)2SO4，20mmol/LMgSO4，200mmol/LTris-HCl(pH8.8)，1%TritonX-100，1mg/mLBSA。5.2.18TaqDNA聚合酶（5U/µL）。5.2.19溴化乙锭（10mg/ml）：称量100mg溴化乙锭溶解于10mL水中，然后分装成1mL/份，4℃避光保存。5.2.2010mMTris：称量24.22gTris溶于160ml蒸馏水中，加浓HCL调pH至8.0，最后定容至200mL,常温保存。5.2.210.5mol/lEDTA：称量186.1gEDTA溶于800mL蒸馏水中，加NaOH调pH至8.0，最后定容至1000mL，高压灭菌后，常温保存。5.2.2210%SDS：称量10.0gSDS溶于100mL蒸馏水中，55℃水浴锅中助溶。5.2.2320mg/mL蛋白酶K：称量100.0mg蛋白酶K溶于5ml无菌去离子水（ddH2O）中，分装成1mL/份，-20℃保存。5.2.2450×TAE：称量242.0gTris溶于700mL蒸馏水中，加入57.1mL冰乙酸，100mL0.5mol/LEDTA（pH8.0）后定容至1000mL，使用时50倍稀释。5.2.25细胞裂解液：0.5%SDS，0.5%TritonX-100，10mMTrispH7.6，10mMNa2EDTA，8mMMgCl2，8mMNaCl。5.2.26DNA分子量标准：DL2000。5.2.276×loadingBuffer（市售）：含0.25%溴酚蓝，0.25%二甲苯青FF，30%甘油水溶液，4℃保存。6仪器6.1PCR仪。6.2紫外分光光度计。6.3电泳仪。6.4凝胶成像系统。6.5离心机：离心力≥12000g。6.6微量可调移液器：0.2μL～2μL，2μL～20μL，20μL～200μL，100μL～1000μL。6.7涡旋振荡器。6.8电子天平：感量0.0001g本标准仅供内部使用不得翻印本标准仅供内部使用不得翻印DB22/T2260—201536.9恒温水浴锅。7试样制备新鲜、烘干或加工后鹿鞭样品，每个样品采集阴茎前段、中段及睾丸各选取2个点，每个点采集0.5cm3的样品，在液氮下研磨成粉末状，放入冻存管中，-80℃保存。8分析步骤8.1提取DNA8.1.1取处理后的试样约50mg，放入1.5mL离心管中，加入500μL细胞裂解液（5.2.25）摇匀，加入10μL蛋白酶K，充分混匀后放入55℃水浴中温和振荡，消化过夜。8.1.2加入等体积的Tris饱和酚，颠倒混匀离心，上清液转入新的离心管中，重复2次。8.1.3上清液加入等体积的酚和氯仿的混合液(1﹕1)，缓慢混匀10min，4℃12000r/min离心5min，吸取上清。8.1.4上清液中加入等体积的氯仿，颠倒混匀，4℃12000r/min离心5min，吸取上清。8.1.5加入2倍体积的冰乙醇，混匀，4℃12000r/min离心10min，弃上清液。8.1.6加入75%乙醇500μL，4℃12000r/min离心10min，弃上清，沉淀核酸。8.1.7在65℃烘箱中干燥5min；8.1.8加入100μL超纯水，溶解，-20℃保存。注：也可用DNA提取试剂盒提取，按照试剂盒操作说明书指示进行操作。8.2PCR检测8.2.1PCR反应体系PCR反应体系见表1，同时设置阴性对照（无菌水）。表1PCR反应体系成分用量/(μL)10×Buffer2.5dNTP/(2.5mM)3.0上游引物/(10μM)0.5下游引物/(10μM)0.5Taq酶/(5U/μL)0.5DNA模板1.5ddH2O16.5注：按照上述试剂顺序逐项加样至0.2mL的PCR反应管中，混匀后瞬离。8.2.2PCR反应程序预变性95°C，10min；循环扩增94℃,1min，56℃,50s，72℃,1min，30个循环；延伸72℃，10min。4℃保存。本标准仅供内部使用不得翻印本标准仅供内部使用不得翻印DB22/T2260—201548.2.3扩增产物电泳用1×TAE电泳缓冲液配制成1%琼脂糖平板（溴化乙锭终浓度0.5μg/mL）。将平板放入水平电泳槽中，加入1×TAE电泳缓冲液刚刚高出凝胶表面，将PCR扩增产物6μL与1μL上样缓冲液混合，分别加入样品孔中，取5μLDNAMarkerDL2000加入到标准分子量对照孔内。5V/cm恒压电泳30min-45min。凝胶成像系统下观察并分析。9结果判定若待检样品出现306bp或307bp特异性片段，即判定为梅花鹿或马鹿鹿鞭。必要时取PCR扩增产物进行测序，如果结果与附录A参考序列比较，序列相似性在95%以上，可进一步确认待测样品结果为阳性。10废弃物处理和防止污染的措施10.1检测过程中的废弃物需经121℃高压灭菌处理至少30min。10.2检测过程中防止交叉污染的措施见WS/T230-2002中第六章规定执行污染的预防和控制规定。本标准仅供内部使用不得翻印本标准仅供内部使用不得翻印DB22/T2260—20155AA附录A（资料性附录）梅花鹿、马鹿的特征性序列A.1梅花鹿特异扩增片段序列（307bp）：ACAAAGCACGTGATATAACCTTATGTGTTTGTAGTACATAAAATTAATGCATTAAGGCACACATGTACAATGGTACATAAAATCGGTGTATAGGACATATTATGCATAATAGTACATAAATTAATGTATTAGGACATACTATGTATAATAGTACATTATATTATATGCCCCATGCTTATAAGCATGTATTTTCTATTATCTACAGTACATAGTACATGATGTTGCTTATCGTACATAGCGCATTGAGTCAAATCAGTCCTCGTCAGCATGCGTATCCCGTCCACTAGATCACGAGCTTGATCACCATGA.2马鹿特异扩增片段序列（306bp）：GCAAAACACGTGATATAACCTTATGCGCTTGTAGTACATAAAATCAATGTACTAGGACATGCATGTATAACAGTACATAAGTTAGCGTATAGGACATATTATGTATAATAGTACATAAATTAATGTATCAGGACATATTATGTATAATAGTACATTATATTATATGCCCCATGCTTATAAGCATGTACTTTCTACTATCTAAAGTACATAGTACATAATGTTGTTCATCGTACATAGTACATTAAGTCAAATCAGTCCTTGTCAACATGCGTATCCCGTCCCCTAGATCACGAGCTTAATTACCATG_________________________________本标准仅供内部使用不得翻印本标准仅供内部使用不得翻印