DB41T 987-2014 脱毒甘薯种薯(苗)病毒检测技术规程

ICS65.020B16DB41河南省地方标准DB41/T987—2014脱毒甘薯种薯（苗）病毒检测技术规程Technicalcriterionforvirusdetectionofvirus-freesweetpotatoseedtuberorseedling2014-12-30发布2015-03-01实施河南省质量技术监督局发布DB41/T987－2014I目次前言................................................................................II1范围..............................................................................12术语和定义........................................................................12.1脱毒组培苗....................................................................12.2扩繁苗........................................................................12.3脱毒种薯（苗）................................................................12.4原原种........................................................................12.5原种..........................................................................12.6大田用种......................................................................12.7允许带毒率....................................................................22.8允许病毒显症率................................................................23检测对象..........................................................................24抽样..............................................................................24.1组培苗抽样....................................................................24.2田间抽样......................................................................25检测方法..........................................................................25.1硝酸纤维素膜酶联免疫吸附测定（NCM-ELISA）检测法...............................25.2指示植物检测法................................................................35.3聚合酶链式反应（PCR）检测法...................................................35.4反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）检测法..........................................36脱毒种薯（苗）的检测程序及质量要求................................................36.1脱毒组培苗....................................................................36.2原原种........................................................................36.3原种..........................................................................36.4大田用种......................................................................3附录A（规范性附录）硝酸纤维素膜酶联免疫吸附测定（NCM-ELISA）检测法.................4附录B（规范性附录）指示植物检测法..................................................6附录C（规范性附录）聚合酶链式反应（PCR）检测法.....................................7附录D（规范性附录）反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）检测法............................9DB41/T987－2014II前言本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准由河南省农业科学院提出。本标准起草单位：河南省农业科学院植物保护研究所。本标准主要起草人：张振臣、乔奇、秦艳红、张德胜、王爽、田雨婷、王永江。DB41/T987－20141脱毒甘薯种薯（苗）病毒检测技术规程1范围本标准规定了脱毒甘薯种薯（苗）病毒检测的术语定义、检测对象、抽样、检测方法和脱毒种薯（苗）的检测程序及质量要求。本标准适用于脱毒甘薯种薯（苗）的病毒检测。2术语和定义下列术语和定义适用于本文件。2.1脱毒组培苗virus-freetissuecultureseedling利用茎尖分生组织培养技术获得的再生组培苗，经检测，确认不含甘薯羽状斑驳病毒（Sweetpotatofeatherymottlevirus，SPFMV）、甘薯潜隐病毒（Sweetpotatolatentvirus，SPLV）、甘薯G病毒（SweetpotatovirusG，SPVG）、甘薯病毒2（Sweetpotatovirus2，SPV2）、甘薯褪绿斑病毒（Sweetpotatochloroticfleckvirus，SPCFV）、甘薯褪绿矮化病毒（Sweetpotatochloroticstuntvirus，SPCSV）和甘薯卷叶病毒（Sweetpotatoleafcurlvirus，SPLCV）的种苗。2.2扩繁苗propagationseedling由脱毒组培苗在无菌条件下或者防虫温（网）室内快繁后得到的甘薯苗。2.3脱毒种薯（苗）virus-freeseedtuberorseedling由脱毒组培苗经逐代繁殖增加种薯（苗）数量的种薯（苗）生产体系生产出来的种薯（苗）。分原原种、原种、大田用种三个级别。2.4原原种pre-elite用脱毒组培苗或扩繁苗在防虫网室内生产出的符合质量要求的种薯（苗）。2.5原种elite用原原种作种薯，在隔离条件下生产出的符合质量要求的种薯（苗）。2.6大田用种certifiedseed用原种作种薯，在隔离条件下生产出的符合质量要求的种薯（苗）。2.7允许带毒率permissionvirus-carryingrate各级甘薯种薯（苗）繁殖田中允许携带病毒植株的比率。2.8允许病毒显症率permissionvirus-symptomrateDB41/T987－20142各级甘薯种薯（苗）繁殖田中允许出现病毒病症状植株的比率。3检测对象甘薯羽状斑驳病毒（SPFMV）；甘薯潜隐病毒（SPLV）；甘薯G病毒（SPVG）；甘薯病毒2（SPV2）；甘薯褪绿斑病毒（SPCFV）；甘薯褪绿矮化病毒（SPCSV）；甘薯卷叶病毒（SPLCV）。4抽样4.1组培苗抽样4.1.1脱毒组培苗每株均应检测。4.1.2扩繁苗随机抽取1%～2%的扩繁苗检测。4.2田间抽样4.2.1原原种田抽样定植后30d、60d、收获前2周，在目测的基础上，采用五点取样法。面积≤0.1hm2，抽取数量为200株；0.1hm2＜面积≤1hm2，抽取数量为500株；每超出1hm2面积，划出另一检验区，按本规程规定的面积取样。每株取上、中、下部叶片1g～5g，-20℃以下低温保存。4.2.2原种田和大田用种田抽样定植后30d、收获前两周，在目测的基础上，采用五点取样法。取样方法及样品保存同4.2.1。5检测方法5.1硝酸纤维素膜酶联免疫吸附测定（NCM-ELISA）检测法用于检测SPFMV、SPLV、SPVG、SPV2、SPCFV、SPCSV和SPLCV共7种病毒，检测法见附录A。5.2指示植物检测法用于辅助检测SPFMV、SPLV、SPVG、SPV2、SPCFV、SPCSV和SPLCV共7种病毒，检测法见附录B。5.3聚合酶链式反应（PCR）检测法用于检测SPLCV。检测法见附录C。DB41/T987－201435.4反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）检测法用于检测SPCSV。检测法见附录D。6脱毒种薯（苗）的检测程序及质量要求6.1脱毒组培苗样品同时利用NCM-ELISA、PCR、RT-PCR和指示植物4种方法进行检测，4种方法的检测结果均应为阴性，即允许带毒率为0。6.2原原种先目测调查样品的病毒显症率，然后利用NCM-ELISA或指示植物法进行检测，至少其中10%的样品分别利用PCR和RT-PCR检测。允许带毒率为0，允许病毒显症率为0。6.3原种先目测调查样品的病毒显症率，然后利用NCM-ELISA或指示植物进行检测，至少其中5%的样品分别利用PCR和RT-PCR检测。SPFMV、SPLV、SPVG、SPV2和SPCFV的允许带毒率≤2.0%，SPCSV和SPLCV的允许带毒率为0。允许病毒显症率≤1.0%。6.4大田用种先目测调查样品的病毒显症率，然后利用NCM-ELISA或指示植物进行检测，至少其中1%的样品分别利用PCR和RT-PCR检测。SPFMV、SPLV、SPVG、SPV2和SPCFV的允许带毒率≤10.0%，SPCSV和SPLCV的允许带毒率为0，允许病毒显症率≤5.0%。DB41/T987－20144AA附录A（规范性附录）硝酸纤维素膜酶联免疫吸附测定（NCM-ELISA）检测法A.1溶液配制除非另有规定仅使用分析试剂。水为无菌蒸馏水。A.1.1Tris-HCl溶液[c(Tris-HCl)=1.0mol/L]：称取60.60g的三羟甲基氨基甲烷（Tris）溶于300mL无菌蒸馏水中，加入32.5mL浓盐酸（HCl），调节pH值为7.5，定容至500mL。4℃保存备用。A.1.2氯化钠溶液[c(NaCl)=5.0mol/L]：称取292.20g氯化钠，在800mL无菌蒸馏水中，溶解定容至1L。4℃保存备用。A.1.3三羟甲基氨基甲烷溶液（TBS）：分别取1mol/LTris-HCl（A.1.1）20mL和5mol/L氯化钠（A.1.2）100mL，混合后用无菌蒸馏水定容至1L。A.1.4洗涤缓冲液（TBST）：0.5mL吐温-20（Tween-20）溶于1LTBS（A.1.3）中。A.1.5抽提缓冲液：称取亚硫酸钠（Na2SO3）0.20g溶于TBS（A.1.3）中，定容至100mL。A.1.6封闭缓冲液：称取脱脂奶粉0.50g，分别量取曲拉通（Triton）X-1000.5mL和TBS（A.1.3）25mL。先将脱脂奶粉溶于少量