DB21∕T 2357-2014 A型口蹄疫病毒核酸RT-PCR检测方法

ICS11.220B41DB21辽宁省地方标准DB21/T2357—2014A型口蹄疫病毒核酸RT-PCR检测方法RT-PCRassayforFoot-and-mouthdiseasevirusserotypeAnucleicacid2014-07-29发布2014-09-29实施辽宁省质量技术监督局发布DB21/T2357—2014I前言本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准由辽宁省动物疫病预防控制中心提出。本标准由辽宁省畜牧兽医局归口。本标准起草单位：辽宁省动物疫病预防控制中心、辽宁省动物医学研究院。本标准主要起草人：顾贵波、王宏燕、曹东、薛树山、杨作丰、石霖、杨本勇、李红魁、王克才、吴运谱、郑洪玲、闫海滨、马永春、王国庆DB21/T2357—20141A型口蹄疫病毒核酸RT-PCR检测方法1范围本标准规定了A型口蹄疫病毒（FMDV-A）RT-PCR检测方法的技术要求。本标准规定的RT-PCR方法适用于检测偶蹄动物的水疱皮、水疱液、淋巴结、脊髓等组织样品及食道-咽部分泌物（O-P液）。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。分析实验室用水规格和试验方法口蹄疫诊断技术规范兽医实验室生物安全技术管理规范3缩略语下列缩略语适用于本标准。FMDV-A（Foot-and-mouthdiseasevirusserotypeA）A型口蹄疫O-P（Oesophagus-pharyngeal）食道-咽部分泌物DEPC（Diethypyrocarbonate）焦炭酸二乙酯EDTA（EthyleneDiamineTetraaceticAcid）乙二胺四乙酸dNTP(deoxy-ribonucleosidetriphosphate)脱氧核苷酸三磷酸EB（Ethidiumbromide）溴化乙锭TAE（Tris/Acetate/EDTA）TAE缓冲液PBS（PhosphateBufferedSaline）磷酸盐缓冲液RNA(Ribonucleicacid)核糖核酸DNA（Deoxyribonucleicacid）脱氧核糖核酸cDNA（complementarydeoxyribonucleicacid）互补脱氧核糖核酸RT-PCR（Reverse-transcriptionpolymerasechainreaction）反转录-聚合酶链式反应PCR（PolymeraseChainReaction）聚合酶链式反应TaqDNApolymeraseTaqDNA聚合酶4原理FMDV是一种RNA病毒。RNA反转录产生的cDNA可作为PCR模板进行扩增。根据FMDV-A保守基因序列设计一对引物，在TaqDNApolymerase催化下，以母链DNA为模板，以引物为延伸起点，通过变性、退火和延伸，体外复制出与母链模板DNA互补的子链DNA。DB21/T2357—201425实验器材眼科剪、眼科镊、1.5mL灭菌离心管（经DEPC水处理）、0.2mL薄壁PCR管、500mL量筒、500mL三角瓶、吸头、分析天平、台式低温高速离心机、PCR仪、电泳仪、电泳槽、凝胶成像仪、冰箱、微波炉、组织研磨器、微量移液器。6试剂6.1TRIzolRNA提取试剂或其他商品化的RNA提取试剂。6.2氯仿、异丙醇、无水乙醇。6.31%琼脂糖凝胶（见附录A中A.1）。6.4溴化乙锭（EB，10µg/µL）溶液（见附录A中A.2）。6.550×TAE电泳缓冲液（见附录A中A.3）。6.6焦炭酸二乙酯（DEPC）处理的灭菌双蒸水（DEPC水）（见附录A中A.4）。6.7DNA分子量标准(DL2000Marker)。6.875%乙醇（用DEPC水配制）（见附录A中A.5）。6.9上样缓冲液。6.101×TAE电泳缓冲液。6.11磷酸盐缓冲液（PBS0.01mol/L、pH7.2）（见附录A中A.6）。6.1250%甘油磷酸盐缓冲液（见附录A中A.7）。6.13商品化的一步法或两步法RT-PCR反应试剂。含有：10U/µLAMV反转录酶、50U/µLRNA酶抑制剂、5U/µLTaqDNApolymerase、25mmol/L硫酸镁（MgSO4）溶液、5×RT-PCR缓冲液、2.5mmol/LdNTP混合物、10×RT缓冲液、10×PCR缓冲液、25mmol/L氯化镁（MgCL）和无RNA酶的水。注：除另有规定，所用试剂均为分析纯，水为符合GB/T6682-2008的灭菌双蒸水或超纯水。7引物7.1上游引物：5′-CTTGCACTCCCTTACACCGCG-3′，引物浓度10pm/µL。7.2下游引物：5′-CATGTCCTCTTGCATCTGGTT-3′，引物浓度10pm/µL。8样品对照以灭活的A型口蹄疫病毒细胞培养液作为阳性对照，以灭菌双蒸水作为阴性对照。9操作步骤DB21/T2357—201439.1样品的采集、保存运送和处理9.1.1采样工具采样工具（剪刀、镊子、灭菌小瓶、探杯）应经121℃±2℃，15min高压灭菌并烘干。9.1.2组织样品的采集和保存9.1.2.1样品采集部位可用清水（切忌使用酒精、碘酒等消毒剂消毒、擦拭），剪取病畜的新鲜水疱皮3～5g放入灭菌小瓶中，加入适量50%甘油磷酸盐缓冲液（pH7.2），加盖密封；也可采用无菌器具采集水疱液，装入灭菌小瓶中（可加适量抗菌素），加盖密封，冷冻保存。9.1.2.2在无法采集水疱皮和水疱液时，可采集淋巴结、脊髓等组织样品，装入灭菌小瓶内，加盖密封，冷冻保存。9.1.3食道-咽部分泌物（O-P液）的采集和保存采样探杯在使用前经0.2%柠檬酸或2%氢氧化钠浸泡5min，再用洁净水冲洗。每采完一头动物，探杯要进行消毒并充分清洗。采样时动物站立保定，将探杯随吞咽动作送入食道上部10～15cm处，轻轻来回移动2～3次，然后将探杯拉出。将采集到的8～10mLO-P液倒入灭菌容器中，容器中应事先加有8～10mL磷酸盐缓冲液（0.01mol/L、pH7.2），密封后充分摇匀，冷冻保存。9.1.4样品运送运输时样品容器与采样记录一同装入专用运输容器中。专用运输容器应隔热坚固，内装适当冷冻剂和防震材料。外包装上要加贴生物安全警示标志。9.1.5样品处理9.1.5.1水疱液、O-P液：不需处理，可以直接进行核酸提取。9.1.5.2水疱皮、淋巴结等组织样品：取样品2.0g（淋巴结、肌肉等组织样品去除包膜及其他结缔组织）于洁净、灭菌并烘干的研钵中，加入等量灭菌石英砂充分研磨，加10mL磷酸盐缓冲液(0.01mol/L、pH7.2)混匀制成1:5悬液，4℃浸泡过夜或者-20℃反复冻融2次，每次30min，然后4℃3000rpm离心15min，取上清液转入无菌的1.5mL离心管中，编号备用。9.2RNA的提取9.2.1用TRIzolRNA试剂提取待检样品、阳性对照及阴性对照样品的RNA。9.2.2250µL样品处理液和750µLTRIzol置于一个1.5mL离心管中，振荡数次，静置5min。9.2.3加入250µL氯仿，振荡混匀，室温放置5min，4℃12000rpm，离心15min。9.2.4吸取上层水相到一新的离心管中，加入等量异丙醇，混匀，室温放置15min，4℃12000rpm，离心15min，弃去上清。9.2.5小心吸弃上清，加入1mL75%乙醇（DEPC水配制），小心颠倒以漂洗沉淀及管壁，4℃12000rpm，离心15min。9.2.6小心吸弃上清，沉淀置室温条件下干燥后，加适量DEPC水溶解。9.2.7提取的RNA须在2h内进行RT-PCR扩增，若需长期保存，须放置-70℃冰箱保存。DB21/T2357—201449.3RT-PCR9.3.1一步法反应操作步骤9.3.1.1在0.2mL反应管中依次加入（RT-PCR反应体系为25µL）：无RNA酶的水14.5µL5×RT-PCR缓冲液5µLdNTP0.5µL25mmol/LMgSO41µL上游引物（10pm/µL）1µL下游引物（10pm/µL）1µLRNA模板1µLAMV反转录酶0.5µLTaqDNApolymerase0.5µL9.3.1.2用PCR仪立即进行RT-PCR扩增，同时设立阴、阳性对照。9.3.1.3RT-PCR反应条件为：42℃，30min；94℃，50s，54℃，50s，72℃，50s，共35个循环；最后68℃，7min。9.3.2两步法反应操作步骤9.3.2.1在0.2mL反应管中依次加入（RT反应体系10µL）：无RNA酶的水3.25µL10×RT缓冲液1µL25mmol/LMgCL22µLdNTP1µL下游引物（10pm/µL）1µLRNA模板1µLRNA酶抑制剂0.25µLAMV反转录酶0.5µL42℃水浴30min，合成cDNA。取出直接进行PCR或-20℃保存。9.3.2.2PCR体系（50µL）包括：灭菌双蒸水28.75µL5×PCR缓冲液10µL上游引物（10pm/µL）1µLcDNA10µLTaqDNApolymerase0.25µL首先加入灭菌双蒸水，然后再按照顺序逐一加入上述成分，每一次要加到液面下。全部加完后，混匀，瞬时离心，使液体全部沉降到PCR管底。9.3.2.3PCR反应条件为：95℃预变性5min；94℃，50s，54℃，50s，72℃，50s，共35个循环；最后68℃，7min。9.4扩增产物的电泳检测DB21/T2357—20145制备1%浓度的琼脂糖凝胶板，在电泳槽中加入1×TAE电泳缓冲液，使液面刚刚没过凝胶。取3～5µL扩增产物分别和适量加样缓冲液混合后，加到凝胶孔。加入DL2000MarkerDNA分子质量标准物。恒压（110V）下电泳20～25min，将电泳好的凝胶放入凝胶成像系统上观察结果。9.5试验成立的条件阳性对照的扩增产物经电泳检测，在425bp位置出现特异性条带，阴性对照的扩增产物经电泳检测没有出现425bp目的条带。阴阳性对照同时成立则表明试验有效，否则试验无效。9.6结果判定扩增产物如果在425bp位置出现特异性条带，则判定为A型口蹄疫病毒核酸阳性；如果在425bp未出现特异性条带，则判定为A型口蹄疫病毒核酸阴性。1—阴性对照；2—阳性对照；3—DL2000Marker。DB21/T2357—20146AA附录A（规范性附录）附录AA.11%琼脂糖凝胶琼脂糖（电泳级）1g1×TAE电泳缓冲液加至100mL微波炉中完全融化，温度降至60℃左右时，加入5µL溴化乙锭（EB）溶液，均匀铺板，厚度3～5mm。A.2１%溴化乙锭（EB）溶液溴化乙锭0.2g灭菌双蒸水加至20mLA.350×TAE电泳缓冲液A.3.10.5mol/L乙二铵四乙酸二钠（EDTA）溶液（pH8.0）二水乙二铵四乙酸二钠18.61g灭菌双蒸水80mL氢氧化钠调pH至8.0灭菌双蒸水加至100mLA.3.2TAE(三羟甲基氨基甲烷－乙酸)电泳缓冲液（50×）羟基甲基氨基甲烷（Tris）242g冰乙酸57.1mL0.5mol/L乙二铵四乙酸二钠（EDTA）溶液（pH8.0）100mL灭菌双蒸水加至1000mL用时用灭菌双蒸水稀释使用。A.4DEPC水双蒸水100mLDEPC100µL室温过夜，121℃高压灭菌15min，分装到1.5mLDEPC处理过的离心管。A.575%乙醇（DEPC水配制）无水乙醇（分析纯）75mLDB21/T2357—20147灭菌DEPC水加至100mLA.6磷酸盐缓冲液（PBS0.01mol/L、pH7.2）A.6.125×PB磷酸氢二钠2.74g磷酸二氢钠0.79g蒸馏水加至100mLA.6.21×PBS25×PB40mL氯化钠8.5g蒸馏水加至1000mL用氢氧化钠或盐酸调pH至7.2,121℃高压灭菌15min或过滤。一经使用，于4℃保存不超过3周。A.750%甘油磷酸盐缓冲液（pH7.2）磷酸盐缓冲液(0.01mol/L、pH7.2)与纯甘油等量混合，调整pH至