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ICS65.150B52备案号：江苏省地方标准DBDBDBDB32323232DB32/T1738—2011草鱼出血病病毒（GCHV）逆转录—聚合酶链式反应(RT-PCR)检测方法Testmethodofreversetranscriptionpolymerasechainreaction(RT-PCR)forGrassCarpHemorrhageVirus(GCHV)2011-04-15发布2011-06-15实施江苏省质量技术监督局发布DB32/T1738—2011I前言本标准按GB/T1.1-2009《标准化工作导则第1部分：标准化的结构和编写规则》的规定编写。本标准的附录A为资料性附录。本标准由江苏省海洋与渔业局提出。本标准起草单位：江苏省水生动物疫病预防控制中心。本标准主要起草人：陈辉、邹勇、李婧慧、段翠兰、方苹、刘训猛、倪金俤、王习达、陈静、陈光芸、郭立新。DB32/T1738—20111草鱼出血病病毒（GCHV）逆转录—聚合酶链式反应(RT-PCR)检测方法1范围本标准规定了细胞分离病毒后，用PCR技术诊断草鱼出血病病毒的方法。本标准适用于草鱼出血病病毒的分离和鉴定，适用于本病的流行病学调查、诊断、检疫和检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本部分。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本部分。SC/T7103-2008水生动物产地检疫采样技术规范GB/T15805-2008鱼类检疫方法GB/T6682-2008分析实验室用水规格和试验方法3试剂和材料3.1水应符合GB/T6682-2008中一级水的规格。用于PCR(包括核酸抽提)时所用的水要用DEPC处理以除掉RNA酶3.2GCHV标准株3.3Taq酶-20℃保存，不要反复冻融或温度剧烈变化。3.4逆转录酶AMV10U/mL。-20℃保存，不要反复冻融或温度剧烈变化。3.5RNA抑制剂(RNasin)20U/μL。-20℃保存，不要反复冻融或温度剧烈变化。3.6dNTP(含dCTP,dGTP,dATP,dTTP各10mmoL/L)3.7引物试验用到的一对引物，其扩增出的片段为455bp，其序列如下：F：5’-CGCTTCGCTGTTTATGC-3’R：5’-TTATCAGGTGCCCAGTTTT-3’DB32/T1738—201123.8无水乙醇分析纯，使用前预冷到-20℃。3.9矿物油要求无DNA酶和RNA酶。4器材和设备4.196孔细胞培养板。4.2倒置显微镜。4.3恒温培养箱。4.4普通冰箱和低温冰箱。4.5组织研磨工具。4.6离心机和离心管。4.7PCR扩增仪。4.8电泳仪。4.9微量移液器及吸头。4.10凝胶成像系统。5GCHV病毒的分离5.1采样对有临床症状的鱼，如是体长小于等于4cm的鱼苗取整条鱼，体长4cm～6cm的鱼苗取内脏(包括肾);体长大干6cm的鱼则取脑、肝、肾、脾。而对无症状的鱼要取肾、脾、鳃和脑组织。按SC/T7103-2008采样。5.2样品处理应在10℃以下。先用组织研磨工具将样品组织匀浆成糊状，再按1:10的最终稀释度重悬于培养液中.如果在匀浆前未用抗菌素处理过样品，则须将样品匀浆后再悬浮于含有100U/mL双抗（青霉素、链霉素）的培养液中，于15℃下孵育2h-4h或4℃下孵育6h～24h,差速离心：9000r/min5min，12000r/min15min,收集上清液。5.3病毒分离对1:10的组织匀浆上清液再作两次10倍稀释，然后将这1:10,1:100和1:10003个稀释度的上清液以适当体积分别接种到生长约24h的CIK细胞单层中，每孔(2cm2)的细胞单层最多接种100μL稀释液。15℃-20℃吸附0.5h～lh后，加人细胞培养液。置于24℃士1℃培养。试验中要设有阳性对照(接种GCHV标准株)，和空白对照(未接种病毒的细胞)。阳性对照和待测样品都接种细胞后，7d内每天用40倍到100倍倒置显微镜检查。空白对照细胞应当正常。如果接种了被检匀浆上清稀释液的细胞培养中出现细胞病变(CPE)，应立即进行PCR鉴定。如果除阳性对照细胞外，没有CPE出现，则在培养7d后还要用敏感细胞进行再传代培养。传代时，将接种了组织匀浆上清稀释液的细胞单层培养物冻融一次，以7000r/min,4℃离心15min，收集上清液。将上清液接种到新鲜细胞单层，培养7d。每天用40倍到100倍倒置显微镜检查。如果阳性对照也未出现CPE，则必须换用敏感细胞和一批新的组织样品重新进行另一系列的病毒学检查。DB32/T1738—201136操作步骤6.1样品处理将450μL细胞病变悬液放人1.5ML的离心管，再加人450μLCTAB溶液(见附录A.1)并混匀，25℃作用2h～2.5h。6.2RNA抽提在含有样品的塑料离心管中加人600μL抽提液1(见附录A.2)，用力混合至少30s，12000r/min离心5min，小心取上层水相(约750μL)，再加人650μL抽提液2(见附录A.3)，用力混合至少30s,12000r/min离心5min，小心取上层水相〔约600μL)。再加入-20℃预冷的1.5倍体积的无水乙醇(约900μL)，倒置数次混匀后，-20℃8h以上沉淀核酸。14000r/min离心30min，小心弃去上清。干澡后加12μL水溶解，-80℃冻融一次，用作PCR模板。6.3变性和退火在PCR管中加人10μL模板和1.5μL引物R，加3.5μL水使总体积为15μL,置于90℃反应5min～10min。立即冰浴，低速离心约5s，使液体集中在底部。6.4cDNA合成在上述反应管中继续加入：5μL的5倍逆转录酶浓缩缓冲液(见附录A.5),2μLdNTP,1μLRNA酶抑制剂(20U),1μL逆转录酶AMV(20U)和1μL水。40℃反应60min，再95℃10min灭活。6.5PCR扩增DNA在上述反应管中再继续加入：10倍Taq酶用浓缩缓冲液(见附录A.7)9μL,25mmol/L的氯化镁(见附录A.6)9μL.,dNTP2μL、引物R1μL和引物F1μL,Taq酶1μL、加水到总体积为100μL,每管加入50μL矿物油。短时间低速离心让矿物油集中在上层。再将反应管置于PCR扩增仪。按照：94℃4min→94℃1min→57℃1min→72℃1.5min35次循环,72℃10min→4℃保温。6.6琼脂糖电泳用TBE电泳缓冲液(见附录A.4)配制1%的琼脂糖(含0.5μg/mLEB见附录A.8)平板。将平板放人水平电泳槽，使电泳缓冲液刚好淹没胶面将6μL样品和2μL样品缓冲液(见附录A.9)混匀后加入样品孔。在电泳时设立DNA标准分子量作对照，5V/cm电泳约0.5h，当溴酚蓝到达底部时停止。在凝胶成像系统下观察核酸带并判断结果,结果图见图1。6.8设立对照6.8.1在6.1样品处理过程中必须设立阳性对照、阴性对照和空白对照。6.8.2取含有已知草鱼出血病病毒标准株的细胞悬液作为阳性对照。6.8.3取正常的细胞悬液作为阴性对照。6.8.4取等体积的水代替模板作为空白对照。DB32/T1738—20114图1PCR结果图7结果判定样品经过接种细胞和盲传后均没有CPE出现，则结果判为阴性。有CPE出现，则要用PCR方法鉴定是否由草鱼出血病病毒引起。PCR后阳性对照会出现一条455bp的DNA片段。阴性对照和空白对照没有该核酸带。待测样品PCR扩增后能在相应455bpDNA位置上有带，可判为阳性。无带或带的大小不是455bp判为阴性。DB32/T1738—20115附录A(资料性附录)试剂配制A.1CTAB溶液按CTAB2%，氯化钠1.4mol/L,EDTA20mmol/L,Tris-HCL20mmol/LpH=7.5配制。用前加琉基乙醇至终浓度为0.25%。A.2抽提液11mol/LTris水溶液饱和的酚：三氯甲烷：异戊醇=24：24：1混合，密闭避光保存。A.3抽提液2将三氯甲烷/异戊醇按24:1的比例混合，密闭避光保存。A.4TBE电泳缓冲液(5倍浓缩液)Tris5.4g硼酸27.5gEDTA2.922g水1000mL用5mol/L的盐酸调到pH8。A.5逆转录酶AMV的5倍浓缩缓冲液Tris-盐酸250mmol/L,pH8.3氯化钾250mmol/L氯化镁50mmol/LDTT50mmol/LA.625mmol/L氯化镁A.7Taq酶用10倍浓缩缓冲液Tris-HCL500mmol/L,pH8.8氯化钾500mmol/LTritonX-1001%A.8EB(核酸染色剂)DB32/T1738—20116用水配制成10mg/ml的浓缩液。用时每10mL电泳液或琼脂中加1μL。A.9样品缓冲液每100mL水溶液中含：溴酚蓝：25g，蔗糖40g。