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ICS65.020.30B41备案号：江苏省地方标准DBDBDBDB32323232DB32/T1770—2011A群猪轮状病毒的检测RT-PCR方法MethodofRT-PCRfordetectingPorcineRotavirusgroupA2011-05-06发布2011-07-06实施江苏省质量技术监督局发布DB32/T1770—2011I前言为规范A群猪轮状病毒分子生物学检测技术，提高A群猪轮状病毒检测的灵敏度、稳定性、特异性，特制定本标准。本标准按GB/T1.1-2009《标准化工作导则第1部分：标准的结构和编写》编写。本标准的附录A为规范性附录。本标准由江苏省农业科学院提出。本标准起草单位：江苏省农业科学院。本标准起草人：倪艳秀、何孔旺、郭容利、温立斌、吕立新、张雪寒、周俊明、李成仁、俞正玉、茅爱华、李彬、王小敏。DB32/T1770—20111A群猪轮状病毒的检测RT-PCR方法1范围本标准规定了A群猪轮状病毒的检测RT-PCR方法的所用仪器设备和主要试剂、引物、方法步骤、结果判定、废弃物处理和防止污染的措施等技术标准。本标准适用于A群猪轮状病毒的RT-PCR检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的，凡是注日期的引物文件，仅注日期的版本适用于本文件，凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB16548-2006病害动物和病害动物产品生物安全处理规程GB/T6682-2008分析实验室用水规格和试验方法NY/T541-2002动物疫病实验室检验采样方法3原理RT-PCR是将RNA的反转录（RT）和cDNA的聚合酶链式扩增（PCR）相结合的技术。首先经反转录酶的作用从RNA合成cDNA，再以cDNA为模板，扩增合成目的片段。本标准根据GenBank上公布的A群猪轮状病毒（PRV）衣壳蛋白VP7基因序列，在其保守区设计一对特异性引物，先提取待检样品的RNA，用下游引物进行RT，再以cDNA为模板进行PCR。4仪器设备和主要试剂4.1仪器设备4.1.1高速离心机4.1.2PCR仪4.1.3核酸电泳仪4.1.4凝胶成像系统4.2主要试剂除另有规定，所用试剂均为分析纯。4.2.1焦碳酸二乙酯(DEPC)水4.2.2TRIzol4.2.3RNA酶抑制剂4.2.4AMV反转录酶4.2.5Taq酶4.2.6dNTP4.2.7琼脂糖，电泳级DB32/T1770—201125引物上游引物：5′-GTATGGTATTGAATATACCAC-3′；下游引物：5′-GATCCTGTTGGCCATCC-3′。6方法步骤试验用水：按照GB/T6682-2008三级水标准。6.1样品处理6.1.1粪便样品的处理按照NY/T541-2002，采集腹泻猪的粪便，在粪便中按1：10加入DEPC水，剧烈震荡使其混和均匀，5000r/min，离心20min，取上清于-20℃备用。反复冻融三次后，以5000r/min，离心20min，取上清。阴性粪便对照：正常猪粪便。阳性粪便对照：感染A群猪轮状病毒的猪粪便。阴性、阳性粪便对照也同样处理，对每个样品进行编号标记。另外，按照GB16548-2006处理待检粪便。6.1.2可疑细胞培养物样品的处理可疑细胞培养物反复冻融三次后，以5000r/min，离心20min，取上清。阴性细胞培养物对照：正常MA104细胞。阳性细胞培养物对照：A群猪轮状病毒细胞培养物。阴性、阳性细胞培养物对照也同样处理，对每个样品进行编号标记。6.2RNA的提取在200µL上清中加入TRIzol800µL，振荡混匀后，室温放置5min，加入氯仿200µL，剧烈振荡后，室温放置10min，4℃12000r/min，离心10min，取上清，加入0.5mL异丙醇，混匀，-20℃放置2h以上，4℃12000rpm离心15min，去上清，沉淀用1ml75%的无RNA酶的乙醇洗涤，4℃7500r/min离心5min，去上清，室温干燥RNA沉淀20min，加入DEPC水12µL，使充分溶解，-20℃冻存备用。6.3RT-PCR6.3.1反应条件反转录反应：按20µL体系进行，5×Buffer4.0µL、dNTP（10mM）2.0µL、下游引物（50pmol/µL）1.0µL、RNA酶抑制剂0.5µL、RNA模板12.0µL，AMV反转录酶0.5µL，瞬间离心混匀，65℃反应15min，42℃孵育1h，95℃5min，同时设立阴性、阳性对照，产物于-20℃保存备用。PCR反应：按25µL体系进行，10×buffer2.5µL，MgCl2（25mM）1.0µL，dNTP（2.5mM）1.0µL，上游引物（50pmol/µL）0.5µL，下游引物（50pmol/µL）0.5µL，模板DNA3.0µL，Taq酶（5U/µL）0.5µL，灭菌水16.0µL。按如下条件进行PCR反应。95℃5min，然后进入循环94℃1min，55.0℃1min，72℃1min，35个循环，于72℃延伸10min，4℃保存。6.3.2电泳将PCR反应产物于1.0%琼脂糖凝胶进行电泳，电压为120V，时间30min。DB32/T1770—201136.3.3结果观察用凝胶成像系统观察结果，并进行拍照。7结果判定7.1试验结果成立条件阳性对照的PCR产物电泳后在342bp的位置上出现一条特异性条带，阴性对照PCR产物电泳后没有条带，试验结果成立;否则，结果不成立7.2结果判定7.2.1在试验结果成立的前提下，如果检测样品中PCR产物电泳后在342bp的位置上出现一条特异性条带，判为阳性，即该样品为A群猪轮状病毒核酸阳性。7.2.2在试验结果成立的前提下，如果检测样品中PCR产物电泳后在342bp的位置上未出现一条特异性条带，判为阴性，即该样品为A群猪轮状病毒核酸阴性。7.2.3如果阳性对照无相应的目的条带，可能是存在操作失误，该试验需要做重复试验；如果阴性对照有相应的目的条带，可能是阴性对照存在污染或是操作失误，该试验需要做重复试验。8废弃物处理和防止污染的措施检测过程中的废弃物，应收集后高压灭菌处理。检测过程中防止交叉污染的措施见附录A。DB32/T1770—20114附录A(规范性附录)检测过程中防止交叉污染的措施A.1抽样和制样过程抽样和制样工具，应清洗干净，121℃,15～20min灭菌，一套清洁工具限于一个样品使用。存放样品的容器应该经过清洗、灭菌，或为一次性灭菌容器。A.2检测过程A.2.1PCR实验室应分为样品制备区、前PCR区、PCR区、后PCR区。将模板提取、PCR反应液配制、PCR循环扩增及PCR产物的鉴定等步骤分区或分室进行。实验室的运作应从“净区”到“脏区”单方向进行。A.2.2实验过程中，应穿实验服和戴手套，手套要经常更换。各区要有专用实验服，经常清洗。A.2.3各区所有的试剂、器材(尤其是移液器)、仪器都应专用，不得带出该区。A.2.4所有溶液、水、耗材和器具要121℃,15～20min灭菌，避免核酸和(或)核酸酶污染。每种溶液应使用高质量的成分和新蒸馏的双蒸水。在20～25℃贮存的试剂中，可加0.025%的叠氮钠。所有试剂应该以大体积配制，然后分装成仅够一次使用的量进行贮存。A.2.5装有DNA模板或引物的离心管打开之前，要简短离心，离心管不能用力崩开，以免产生气溶胶。A.2.6前PCR区中，最好能在PCR操作箱中加人PCR反应各组分。A.2.7实验前后，实验室用紫外线消毒以破坏残留的DNA。A.2.8可使用UDG和dUTP系统控制污染。DB32/T1770—20115附录B(规范性附录)RT-PCR扩增产物参考序列本标准参照的序列为GenBank上公布的PRV衣壳蛋白(vp7)部分基因序列(ORF2-342bp)1EF474079（阿根廷）Gtatggtattgaatataccacaattctaatcttcttgacatcgattacattgctaaattatatcttaaaatcaataacaagagtaatggactatataatttacagatttctgcttatagtggtaatcttggccaccatgataaatgcgcagaattatggagtgaatttgccaattacaggttcaatggatactgcatacgcaaattctacgcaaagtgagccatttttaacatcaactctttgtttgtattatcctgttgaggcatcaaacgaaatagctgatactgaatggaaagatcccttatcacaactgttcttgacaaaaggatggccaacaggatc