DB12T 504-2014 水稻转基因成分筛查方法

ICS65.020.01B04天津市地方标准DB12DB12/T504—2014水稻转基因成分筛查方法Screeningmethodforgeneticallymodifiedrice2014-04-22发布2014-07-20实施天津市质量技术监督局发布DB12/T504—20141前言本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本标准由天津市质量技术监督局提出。本标准起草单位：天津市东丽区产品质量监督检验所、天津市农业质量标准与检测技术研究所。本标准主要起草人：黄凤军、朱珠、易萌、杨炳存、刘文、赵新、李阳、闫荣卿。本标准2014年04月首次发布。DB12/T504—20141水稻转基因成分筛查方法1范围本标准规定了水稻中转基因成分定性PCR筛查的术语和定义、检测方法、结果分析与表述。本标准适用于水稻及其制品中SPS基因、CaMV35S启动子、NOS终止子、Bt基因、NPTII基因和HPT基因的定性PCR筛查检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法NY/T672转基因植物及其产品检测通用要求农业部1485号公告—4—2010转基因植物及其产品成分检测DNA提取和纯化农业部2031号公告—19—2013转基因植物及其产品检测抽样3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1SPS基因SPSgene编码蔗糖磷酸合酶（sucrosephosphatesynthase）的基因。3.2CaMV35S启动子35Spromoterfromcauliflowermosaicvirus（CaMV）来自花椰菜花叶病毒的35S启动子。3.3NOS终止子terminatorofnopalinesynthase（NOS）gene来自胭脂碱合成酶基因NOS的终止子。3.4Bt基因Bt（Bacillusthuringiensis）gene来源与苏云金芽胞杆菌（Bacillusthuringiensis，简称Bt），可表达一种杀虫晶体蛋白的基因，常见的Bt基因有cry1Ac基因、cry1Ab基因、cry1Ab/cry1Ac融合基因。3.5NPTII基因NPTIIgene来源于大肠杆菌（Escherichiacoli），编码新霉素磷酸转移酶（neomycinphosphotransferase）的基因。。3.6HPT基因HPTgene来自大肠杆菌或链球菌（Streptomyceshygroscopicus），编码潮霉素磷酸转移酶（hygromycinphosphotransferase）的基因。DB12/T504—201424检测方法4.1试剂和材料4.1.1实验用水为重蒸馏水或符合GB/T6682规定的一级水。4.1.2琼脂糖。4.1.310g/L溴化乙锭溶液：称取1.0g溴化乙锭（EB），溶于100mL水中，避光保存。注：溴化乙锭有致癌作用，配制和使用时应戴一次性手套操作并妥善处理废液。4.1.410mol/L氢氧化钠溶液：在160mL水中加入80.0g氢氧化钠（NaOH），溶解后再加水定容到200mL。4.1.5500mmol/L乙二铵四乙酸二钠溶液（pH8.0）：称取18.6g乙二铵四乙酸二钠（EDTA-Na2），加入70mL水中，再加入适量氢氧化钠溶液（4.1.4），加热至完全溶解后，冷却至室温，用氢氧化钠溶液（4.1.4）调pH至8.0，加水定容至100mL。在103.4kPa（121℃）条件下灭菌20min。4.1.61mol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸溶液（pH8.0）：称取121.1g三羟甲基氨基甲烷（Tris）溶解于800mL水中，用盐酸调pH至8.0，加水定容至1000mL。在103.4kPa（121℃）条件下灭菌20min。4.1.7TE缓冲液（pH8.0）：分别量取10mL三羟甲基氨基甲烷-盐酸溶液（4.1.6）和2mL乙二铵四乙酸二钠溶液（4.1.5），加水定容至1000mL。在103.4kPa（121℃）条件下灭菌20min。4.1.850×TAE缓冲液：称取242.2g三羟甲基氨基甲烷（Tris），先用300mL水加热搅拌溶解后，加100mL乙二铵四乙酸二钠溶液（4.1.5），用冰乙酸调pH至8.0，然后加水定容到1000mL。使用时用水稀释成1×TAE。4.1.9加样缓冲液：称取250.0mg溴酚蓝，加10mL水，在室温下溶解12h；称取250.0mg二甲基苯腈蓝，用10mL水溶解；称取50.0g蔗糖，用30mL水溶解。混合以上三种溶液，加水定容至100mL，在4℃下保存。4.1.10DNA分子量标准：可以清楚的区分50bp～1000bp的DNA片段。4.1.11dNTPs混合溶液：将浓度为10mmol/L的dATP、dTTP、dGTP、dCTP四种脱氧核糖核苷酸溶液等体积混合。4.1.12TaqDNA聚合酶、PCR反应缓冲液及25mmol/L氯化镁溶液。4.1.13引物：水稻内标准基因和转基因水稻外源基因检测时所用的引物序列见表1。表1水稻内标准基因和转基因水稻外源基因引物序列检测基因引物序列扩增片段长度基因性质SPSSPS-F：5′-ATCTGTTTACTCGTCAAGTGTCATCTC-3′SPS-R：5′-GCCATGGATTACATATGGCAAGA-3′287bp内标准基因CaMV35S35S-F：5′-GCTCCTACAAATGCCATCATTGC-3′35S-R：5′-GATAGTGGGATTGTGCGTCATCCC-3′195bp外源基因NOSNOS-F：5′-GAATCCTGTTGCCGGTCTTG-3′NOS-R：5′-TTATCCTAGTTTGCGCGCTA-3′180bp外源基因BtBt-F：5′-GAAGGTTTGAGCAATCTCTAC-3′Bt-R：5′-CGATCAGCCTAGTAAGGTCGT-3′301bp外源基因NPTIINpt-F：5’-ACTGGGCACAACAGACAATCG-3’Npt-R：5’-GCATCAGCCATGATGGATACTTT-3’289bp外源基因HPThpt-F：5’-GAAGTGCTTGACATTGGGGAGT-3’hpt-R：5’-AGATGTTGGCGACCTCGTATT-3’472bp外源基因DB12/T504—201434.1.14引物溶液：用TE缓冲液（4.1.7）或水分别将上述引物稀释到10µmol/L。4.1.15石蜡油。4.1.16PCR产物回收试剂盒。4.1.17DNA提取试剂盒。4.2仪器4.2.1分析天平：感量0.1g和0.1mg。4.2.2PCR扩增仪：升降温速度1.5℃/s，孔间温度差异1.0℃。4.2.3电泳槽、电泳仪等电泳装置。4.2.4紫外透射仪。4.2.5凝胶成像系统或照相系统。4.2.6重蒸馏水发生器或纯水仪。4.2.7其他相关仪器设备。4.3分析步骤4.3.1抽样按NY/T672和农业部2031号公告—19—2013规定的执行。4.3.2试样准备按NY/T672和农业部2031号公告—19—2013规定的执行。4.3.3试样预处理按农业部1485号公告—4—2010规定的执行。4.3.4DNA模板制备按农业部1485号公告—4—2010规定的执行。4.3.5PCR反应4.3.5.1试样PCR反应4.3.5.1.1每个试样PCR反应设置3次重复。4.3.5.1.2在PCR反应管中按表2依次加入反应试剂，混匀，再加25µL石蜡油（有热盖设备的PCR仪可不加）。表2PCR检测反应体系试剂终浓度体积水——10×PCR缓冲液1×2.5µL25mmol/L氯化镁溶液1.5mmol/L1.5µLdNTPs混合溶液（各2.5mmol/L）各0.2mmol/L2.0µL10µmol/L正向引物0.2～0.5µmol/L0.5～2.5µLDB12/T504—2014410µmol/L反向引物0.2～0.5µmol/L0.5～2.5µLTaq酶0.025U/µL——25mg/LDNA模板2mg/L2.0µL总体积25.0µL根据Taq酶的浓度确定其体积，并相应调整水的体积，使反应体系总体积达到25.0µL。如果PCR缓冲液中含有氯化镁，则不加氯化镁溶液，加等体积水。注：SPS基因PCR检测反应体系中，上下游引物分别是SPS-F1和SPS-R，引物终浓度分别为0.2µmol/L；CaMV35S启动子PCR检测反应体系中，上下游引物分别是35S-F和35S-R，引物终浓度分别为0.4µmol/L；NOS终止子PCR检测反应体系中，上下游引物分别是NOS-F和NOS-R，引物终浓度分别为0.4µmol/L；Bt基因PCR检测反应体系中，上下游引物分别是Bt-F和Bt-R，引物终浓度分别为0.5µmol/L；NPTII基因PCR检测反应体系中，上下游引物分别是Npt-F和Npt-R，引物终浓度分别为0.2µmol/L；HPT基因PCR检测反应体系中，上下游引物分别是hpt-F和hpt-R，引物终浓度分别为0.2µmol/L。4.3.5.1.3将PCR管放在离心机上，500g~3000g离心10s，然后取出PCR管，放入PCR扩增仪中。4.3.5.1.4进行PCR反应。反应程序按表3进行。表3PCR反应程序被扩增的基因变性扩增循环次数最终延伸SPS94℃，5min94℃，30s58℃，30s72℃，30s3572℃，2minCaMV35S94℃，5min94℃，30s60℃，30s72℃，30s3572℃，7minNOS94℃，5min94℃，30s60℃，30s72℃，30s3572℃，7minBt95℃，5min94℃，1min56℃，30s72℃，30s3572℃，7minNPTII94℃，5min94℃，30s60℃，30s72℃，30s3572℃，7minHPT94℃，5min94℃，30s60℃，30s72℃，30s3572℃，7min4.3.5.1.5反应结束后取出PCR管，对PCR反应产物进行电泳检测。4.3.5.2对照PCR反应在试样PCR反应的同时，应设置阴性对照、阳性对照和空白对照。以非转基因水稻基因组DNA作为阴性对照；以含有SPS、CaMV35S、NOS、Bt、NPTII、HPT基因的转基因水稻质量分数为0.1%~1.0%的基因组DNA作为阳性对照；以水作为空白对照。DB12/T504—20145各对照PCR反应体系中，除模板外，其余组分及PCR反应条件与7.5.1相同。4.3.6PCR产物电泳检测按20g/L的质量浓度称量琼脂糖，加入1×TAE缓冲液中，加热溶解，配制成琼脂糖溶液。每100mL琼脂糖溶液中加入5µLEB溶液，混匀，稍适冷却后，将其倒入电泳板上，插上梳板，室温下凝固成凝胶后，放入1×TAE缓冲液中，垂直向上轻轻拔去梳板。取12µLPCR产物与3µL加样缓冲液混合后加入凝胶点样孔，同时在其中一个点样孔中加入DNA分子量标准，接通电源在2V/cm~5V/cm条件下电泳检测。4.3.7凝胶成像分析电泳结束后，取出琼脂糖凝胶，置于凝胶成像系统或紫外透射仪上成像。根据DNA分子量标准估计扩增条带的大小，将电泳结果形成电子文件存档或用照相系统拍照。如需通过序列分析确认PCR扩增片段是否为目的DNA片段，按照4.3.8和4.3.9的规定执行。4.3.8PCR产物回收按PCR产物回收试剂盒说明书，回收PCR扩增的DNA片段。4.3.9PCR产物测序验证将回收的PCR产物克隆测序，与水稻SPS、CaMV35S、NOS、Bt、NPTII、HPT基因序列（参见附录A）进行比对，确定PCR扩增的DNA片段是否为目的DNA片段。5结果分析与表述5.1对照检测结果分析阳性对照的PCR反应中，内标准基因和外源基因均得到扩增，且扩增片段大小与预期片段大小一致，而在阴性对照中仅扩增出内标准基因片段，空白对照中没有任何扩增片段，表明PCR反