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ICS11.220B41DB21辽宁省地方标准DB21/T2252—2014Ｏ型口蹄疫病毒RT-PCR检测方法MethodofRT-PCRforthedetectionoftypeOfootandmouthdiseasevirus2014-03-07发布2014-05-07实施辽宁省质量技术监督局发布DB21/T2252—20141Ｏ型口蹄疫病毒RT-PCR检测方法1范围本标准规定了Ｏ型口蹄疫病毒（FMDV-O）RT-PCR检测方法的实验材料、仪器设备、试剂、操作步骤和结果判定，并介绍了其原理。本标准适用于动物及动物产品中Ｏ型口蹄疫病毒的检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682-1992分析实验室用水规格和试验方法中华人民共和国农业部公告第302号兽医实验室生物安全技术管理规范3缩略语下列缩略语适用于本标准。DEPC焦炭酸二乙酯RNA核糖核酸RT-PCR反转录聚合酶链反应dNTP脱氧核苷酸三磷酸bp碱基对Ｏ-P液牛、羊食道-咽部分泌物4原理FMDV是一种RNA病毒。RNA反转录产生的cDNA可作为PCR模板进行扩增。根据FMDV-O保守基因序列设计一对引物，在DNA聚合酶催化下，以母链DNA为模板，以引物为延伸起点，通过变性、退火和延伸，体外复制出与母链模板DNA互补的子链DNA。5实验材料、仪器设备和试剂5.1实验材料眼科剪、眼科镊、称量纸、1.5mL灭菌离心管（经DEPC水处理）、0.2mL薄壁PCR管、琼脂糖、500mL量筒、500mL三角瓶、吸头（10µL、200µL、1000µL）。5.2仪器设备DB21/T2252—20142分析天平、低温高速离心机、PCR扩增仪、电泳仪、电泳槽、紫外凝胶成像仪（或紫外分析仪）、－70℃冰箱、微波炉、组织研磨器、－20℃冰箱、可调移液器（最大量程分别为2µL、20µL、200µL、1000µL）。5.3试剂5.3.12.5mmol/LdNTP。5.3.2引物：上游引物5′-AGATTTGTGAAAGTAACACCA-3′，下游引物5′-CATGTCCTCTTGCATCTGGTT-3′。5.3.310倍PCR缓冲液。5.3.41%溴化乙锭（EB）溶液（见第A.1）。5.3.5电泳缓冲液（50倍）（见第A.2）。5.3.61%琼脂糖凝胶（见第A.3）。5.3.775%乙醇（见第A.4）。5.3.8灭菌DEPC水（见第A.5）。5.3.9上样缓冲液(见第A.6)。5.3.10电泳缓冲液（1倍）（见第A.7）。5.3.11磷酸盐缓冲液（0.04mol/L、pH7.4）（见第A.8）。5.3.12其他试剂：10U/µLAMV反转录酶、50U/µLRNA酶抑制剂、5U/µLTaqDNA聚合酶、异丙醇、25mmol/L氯化镁溶液。注：除另有规定，所用试剂均为分析纯，水为符合GB/T6682－1992的灭菌双蒸水或超纯水。6操作步骤6.1样品的采集、保存运送和处理6.1.1样品采集6.1.1.1水泡液：未破裂水泡中的水泡液用灭菌注射器吸出后装入灭菌小瓶中（可加青霉素1000UI/mL，链霉素1mg/mL），加盖密封，编号。6.1.1.2水泡皮：剪取新鲜水泡皮3～5g放入灭菌小瓶中，加6～10mL（2倍体积）50％甘油－磷酸盐缓冲液(0.04mol/L、pH7.4),加盖密封，编号。6.1.1.3肌肉或组织样品：无菌采集淋巴结、脊髓、肌肉等组织样品3～5g装入洁净的小瓶内或其他灭菌容器，编号。6.1.1.4O-P液样品：被检动物在采样前禁食(可饮水)12小时，以免反刍胃内容物严重污染O-P液。采样探杯在使用前经0.2％柠檬酸或2％氢氧化钠浸泡5min，再用自来水冲洗。每采完一头动物,探杯要重复进行消毒和清洗。采样时动物站立保定，将探杯随吞咽动作送入食道上部10～15cm处，轻轻来回移动2～3次，然后将探杯拉出。如采集的O-P液被反刍胃内容物严重污染，要用生理盐水或自来水DB21/T2252—20143冲洗口腔后重新采样。将探杯采集到的8～10mLO-P液倒入25mL以上的灭菌玻璃容器中,容器中应事先加有8～10mL细胞培养液或磷酸盐缓冲液(0.04mol/L、pH7.4)，加盖密封后充分摇匀，编号。6.1.2样品保存与运送6.1.2.1样品保存：采集的样品冷藏送检或尽快冷冻保存，避免反复冻融。6.1.2.2样品运送：样品装入保温壶或保温桶中加冷冻剂和防震材料，加盖密封，以最快方式，运送到实验室。按照《兽医实验室生物安全技术管理规范》进行样品的生物安全标识。6.1.3样品处理6.1.3.1水泡液：不需处理，可以直接进行核酸提取。6.1.3.2水泡皮、肌肉或组织样品：取待检样品2.0g于洁净、灭菌并烘干的研钵中充分研磨，加10mL磷酸盐缓冲液(0.04mol/L、pH7.4)混匀制成1：5悬液，4℃下3000rpm离心15min，取上清液转入无菌的1.5mLEppendorf管中，编号备用。6.1.3.3OP液样品：样品在混匀器上充分混合后，室温放置30min，取上清液转入无菌的1.5mLEppendorf管中，编号备用。6.1.3.4阳性对照：以灭活的口蹄疫病毒细胞培养物作为阳性对照。6.1.3.5阴性对照：以灭菌双蒸水作为阴性对照。6.2RT－PCR检测6.2.1病毒RNA的提取6.2.1.1取n个新的经DEPC水处理过的1.5mL灭菌Eppendorf管，其中n为被检样品、阴性对照、阳性对照的数量之和，编号。6.2.1.2每管加入750µL裂解液，然后分别加入处理过的被检样品、阴性对照、阳性对照各250µL，颠倒混匀，室温静置5min。6.2.1.3每管加入250µL氯仿，盖紧离心管，用手剧烈摇荡离心管15s（或混匀器上振荡混匀15s），室温放置15min。6.2.1.44℃、12000g离心15min，取上层水相0.5mL于一新的经DEPC水处理过的1.5mL灭菌Eppendorf管中，每管加入0.5mL异丙醇，颠倒混匀，室温放置10min，4℃、12000g离心15min。6.2.1.5小心弃去上清液，倒置于吸水纸上，沾干液体，不同样品应在吸水纸不同地方沾干，加入－20℃预冷的75%乙醇1mL，轻轻旋转洗涤后于4℃、12000g离心10min。6.2.1.6小心弃去上清液，倒置于吸水纸上，沾干液体，不同样品应在吸水纸不同地方沾干，室温放置或真空干燥5～10min，不能过于干燥，以免降低RNA的溶解度。6.2.1.7每管加20µLDEPC水和1µLRNA酶抑制剂，轻轻混匀，溶解管壁上的RNA，－70℃保存备用。6.2.2RT－PCR扩增6.2.2.1RT－PCR反应体系组成（总体积25µL）DB21/T2252—20144DEPC水13.5µL2.5mmol/LdNTP2µL10µmol/L上游引物1µL10µmol/L下游引物1µL25mmol/L氯化镁溶液1.5µL10倍PCR缓冲液2.5µLAMV反转录酶0.5µLRNA酶抑制剂0.5µL5U/µLTaqDNA聚合酶0.5µL提取的RNA2µL6.2.2.2RT－PCR反应程序42℃45min，95℃3min；扩增条件为94℃50s，58℃50s，72℃50s，35个循环后，72℃延伸10min。6.2.3电泳将PCR扩增产物6－8µL与1－2µL上样缓冲液混合，加样于1%琼脂糖凝胶孔中，琼脂糖凝胶板一侧点样孔加入DL2000MarkDNA分子质量标准物，以5V/cm电压电泳30min，用紫外凝胶成像仪观察结果。7结果判定当阳性对照出现650bp扩增带，阴性对照未出现目的带时，实验结果成立。被检样品出现650bp扩增带为O型口蹄疫病毒阳性，未出现相应扩增带的样品判为阴性。1——阳性样品；2——阴性对照；3——DNA2000MarkerDB21/T2252—20145附录A（规范性附录）试剂的配制A.1１%溴化乙锭（EB）溶液溴化乙锭0.2g灭菌双蒸水加至20mLA.2电泳缓冲液（50倍）A.2.10.5mol/L乙二铵四乙酸二钠（EDTA）溶液（pH8.0）二水乙二铵四乙酸二钠（分析纯）18.61g灭菌双蒸水80mL氢氧化钠调pH至8.0灭菌双蒸水加至100mLA.2.2TAE(三羟甲基氨基甲烷－乙酸)电泳缓冲液（50倍）羟基甲基氨基甲烷（Tris）（分析纯）242g冰乙酸57.1mL0.5mol/L乙二铵四乙酸二钠（EDTA）溶液（pH8.0）100mL灭菌双蒸水加至1000mL用时用灭菌双蒸水稀释使用。A.31%琼脂糖凝胶琼脂糖（电泳级）2gTAE电泳缓冲液4mL灭菌双蒸水196mL微波炉中完全融化，加溴化乙锭（EB）溶液20µL。A.475%乙醇无水乙醇（分析纯）750mL灭菌DEPC水250mLA.5灭菌DEPC水双蒸水1000mLDEPC1mL用磁力搅拌器室温下持续搅拌过夜，分瓶包装后121℃高压灭菌25min。DB21/T2252—20146A.6上样缓冲液溴酚蓝0.2g，加双蒸水10mL过夜溶解，50g蔗糖加入50mL水溶解后，移入已溶解的溴酚蓝溶液中，摇匀定容至100mL。A.7电泳缓冲液（1倍）电泳缓冲液（50倍）10mL灭菌双蒸水490mLA.8磷酸盐缓冲液的配制A.8.10.1mol/L磷酸盐缓冲液氯化钠（NaCl）80.0g氯化钾（KCl）2.0g磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H2O）30.0g磷酸二氢钾（KH2PO4）2.0g蒸馏水（dH2O）1000mLA.8.20.04mol/L磷酸盐缓冲液（pH7.4）0.1mol/L磷酸盐缓冲液400mL蒸馏水（dH2O）600mL调整pH至7.4，103kPa高压蒸汽30min。4℃冰箱保存。A.8.350%甘油－磷酸盐缓冲液（pH7.4）0.04mol/L磷酸盐缓冲液与纯甘油（A.R.）等量混合，调整pH至7.4，103kPa高压蒸汽30min。4℃冰箱保存。_________________________________