DB13T 1567-2012 葡萄品种DNA指纹鉴定方法

ICS65.020.01B05DB13河北省地方标准DB13/T1567—2012葡萄品种DNA指纹鉴定方法2012-07-03发布2012-07-15实施河北省质量技术监督局发布DB13/T1567—2012I前言本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。标准由河北省林业局提出。本标准起草单位：河北农业大学。本标准主要起草人：梁海永、杨敏生、刘兴菊、宪立杰、张军、杨立华、王进茂、甄红伟、姚伟明周晓霞、王瑞霞。DB13/T1567—20121葡萄品种DNA指纹鉴定方法1范围本标准规定了葡萄品种DNA指纹鉴定的方法及判定标准。本标准适用于河北省葡萄品种鉴定及葡萄品种DNA指纹库的建立,其他省份可参照执行。2原理葡萄全基因组测序已经完成。不同葡萄品种由于遗传组成不同，基因组DNA中简单重复序列的重复次数有差异，这种差异可经过PCR扩增、电泳分离、显色程序绘制的DNA指纹图谱加以区分，从而对不同品种进行鉴定。从葡萄幼苗、叶片等组织中提取总DNA，利用SSR引物对位于不同染色体上的SSR位点进行PCR扩增，不同碱基长度的PCR扩增产物通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离（或通过DNA分析仪、测序仪进行分离），并通过染色显示DNA指纹谱带类型。3仪器设备及试剂仪器设备及试剂名单见参附录A。4溶液配制相关溶液配制方法见附录B。5操作程序5.1样品准备5.1.1取样量每份送检样品至少检测3个个体，对一致性差的样品应增加检测个体至5个。5.1.2品种比较方式成对品种的比较:送检样品提供两份，一份为待检品种，一份为对照品种。将待检品种与对照品种直接进行成对比较。杂交后代需提供母本与父本的样品。品种与DNA指纹库入库品种的比较:送检样品可提供一份。将待检样品与DNA指纹库所有入库品种的指纹进行比较，筛选出指纹最相似或相同的品种作为待检品种的近似品种，然后将待检品种与近似品种直接进行成对比较。5.2DNA提取DB13/T1567—20122采用改良的CTAB法。取200mg干净叶片置入1.5mL离心管中，加入500μLDNA提取液研磨碎，并加1mL洗涤液及30μLβ-巯基乙醇，充分摇匀后置冰上5min，于4℃，12000g离心8min后，洗涤一次，弃上清，再加700μL预热的CTAB缓冲液,充分混匀后，于65℃水浴60min，其间颠倒几次。然后于室温冷却4min～5min，取上清,加等体积的酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1),混匀抽提，室温静置5min，于室温12000g离心8min。上清液移于一新的1.5mL离心管中，加入等体积氯仿∶异戊醇(24∶1)，充分混匀后室温静置5min，室温12000g离心8min，取上清，重复加等体积氯仿∶异戊醇(24∶1)抽提，取上清加入等体积氯仿抽提一次，取上清液，加入2倍体积的无水乙醇(-20℃)，轻轻混匀后在-20℃沉淀30分钟以上，12000g离心10min，将所得沉淀风干后溶于100μL水中，置4℃冰箱备用。其它保证DNA质量的方法也可采用，应用前需要通过微量紫外分光光度计进行DNA质量与浓度检测。5.3PCR扩增5.3.1SSR扩增基本核心引物名单见附录C。5.3.2反应体系反应液体积为20μL，组分配制应符合表1的规定，（或按比例减少至10μL）。表1PCR反应体系反应组分原浓度终浓度反应体积μLddH2O13.3510×buffer10×1×2MgCl225mmol/L2.5mmol/L2dNTP2.5mmol/L0.15mmol/L1.2Taq酶5U/μL1U0.2引物20μmol/L0.25μmol/L0.25DNA30~50ng/μL1.5~2.5ng/μL15.3.3反应程序94℃预变性5min；94℃变性50s，55℃退火50s，72℃延伸50s,共30个循环；72℃延伸7min，4℃保存。5.4变性聚丙烯酰胺凝胶电泳5.4.1清洗玻璃板用自来水沾洗涤灵将玻璃板反复擦洗干净，双蒸水擦洗两遍，95%乙醇擦洗两遍，干燥。在长板上涂上0.5mL亲和硅烷工作液，带凹槽的短板上涂0.5mL剥离硅烷工作液。操作过程中防止两块玻璃板互相污染。5.4.2组装电泳板待玻璃板彻底干燥后组装电泳板，并用水平仪调平。5.4.3灌胶DB13/T1567—20123在100mL4.5%PAGE胶中加入TEMED和25%过硫酸铵各100μL，迅速混匀后灌胶。待胶流动到下部，在上部轻轻插入梳子，使其聚合至少lh以上。灌胶过程中防止出现气泡。5.4.4预电泳在正极槽中加入1×TBE缓冲液600mL，在负极槽(上槽)加入预热至65℃的I×TBE缓冲液600mL，拔出梳子。90W恒功率预电泳10min～20min。5.4.5变性在20μLPCR样品中加入4μL6×加样缓冲液，混匀后，在PCR仪上运行变性程序:95℃变性5min，4℃冷却10min以上。5.4.6电泳用移液器吹吸加样槽，清除气泡和杂质，插入样品梳子。每一个加样孔点入5μL样品。80W恒功率电泳至上部的指示带(二甲苯青)到达胶板的中部(约40min)。电泳结束后，小心分开两块玻璃板，凝胶会紧贴在长板上。5.5银染5.5.1固定:固定液中轻轻晃动3min。5.5.2漂洗:双蒸水快速漂洗1次，不超过10s。5.5.3银染:染色液中染色约10～15min。5.5.4漂洗:双蒸水快速漂洗，时间不超过10s。5.5.5显影:显影液中轻轻晃动至带纹出现。5.5.6定影:固定液中定影5min。5.5.7漂洗:双蒸水漂洗1min。6结果及判定6.1数据表示以多数个体具有的谱带即主带作为品种的特征谱带，当无法判断主带时，给出各种谱带所占的比率。谱带记录方式:每个核心引物的所有谱带按扩增片段从大到小的顺序编号，用二位代码描述(依次为01、02………)，并确定代表每条谱带的一套标准品种。每个待测品种在每个引物位点上的谱带号用四位代码描述，参照标准品种确定待测品种的谱带号。示例1：在一个核心引物上仅有一条谱带02，品种在该引物位点的谱带代码为0202。示例2：在一个核心引物上有两条谱带02和03，品种在该引物位点的谱带代码为0203。6.2检测及判定标准6.2.1先用19对基本核心引物检测，获得待测品种在19个引物位点的DNA指纹谱带数据，利用19个位点的DNA指纹谱带数据进行品种间比较。亲缘关系较近难以区分时可附加19个参考位点。a)品种间差异位点数≥2，判定为不同品种；DB13/T1567—20124b)品种间差异位点数＝1，判定为相近品种；c)品种间差异位点数＝0，判定为相同或极近似品种。6.2.2对b和c的情况，必要时继续用19对扩展核心引物进行检测，利用38个位点的DNA指纹谱带数据进行品种间比较：a)品种间差异位点数≥2，判定为不同品种；b)品种间差异位点数＝1，判定为相近品种；c)品种间差异位点数＝0，判定为相同或极近似品种。6.3鉴定报告鉴定报告书格式参见附录D。DB13/T1567—20125AA附录A（资料性附录）仪器设备试剂A.1仪器设备A.1.1PCR核酸扩增仪:规格为96孔。A.1.2序列分析电泳槽。A.1.3高压电泳仪:规格为3000V,400mA,400W。A.1.4水平摇床。A.1.5胶片观察灯。A.1.6电子天平。A.1.7微量加样器。A.1.8磁力搅拌器。A.1.9高速离心机。A.1.10微量紫外分光光度计。A.1.11高压灭菌锅。A.1.12pH酸度计。A.2试剂所用试剂均为分析纯，所用水均为去离子水。A.2.1乙二胺四乙酸二钠。A.2.2Tris碱。A.2.3盐酸。A.2.4氢氧化钠。A.2.510×Buffe:缓冲液。A.2.6四种脱氧核苷酸:4×dNTP。A.2.7TaqDNA聚合酶。A.2.8SSR引物。A.2.9矿物油。DB13/T1567—20126A.2.10去离子甲酞胺。A.2.11澳酚蓝。A.2.12二甲苯青FF。A.2.13甲叉双丙烯酰胺。A.2.14丙烯酰胺。A.2.15硼酸。A.2.16脲素。A.2.17亲和硅烷:97%。A.2.18剥离硅烷:2%二甲基二氯硅烷。A.2.19无水乙醇。A.2.20四甲基乙二胺(TEMED)。A.2.21过硫酸铵。A.2.22冰醋酸。A.2.23硝酸银。A.2.24甲醛溶液:37%。DB13/T1567—20127BB附录B（资料性附录）溶液配制B.1DNA提取溶液的配制B.1.10.5mol/LEDTA溶液:186.lgNa2EDTA·2H2O溶于800mL水中，用固体NaOH调pH至8.0，定容至1000mL，高压灭菌。B.1.21mol/LTris-HCI溶液:60.55gTris碱溶于适量水中，加HCI调pH至8.0定容至500mL，高压灭菌。B.1.3洗涤液:100mMTris-HC,lpH8.0;50mMEDTA;1MNaC;l1%β-巯基乙醇;2%PVP。B.1.4CTAB提取缓冲液：100mmol/LTris-HCl（pH8.0），20mmol/LEDTA-Na2，1.4mol/LNaCl，2%CTAB，使用前加入0.1%（V/V）的β-巯基乙醇(注：先将除巯基乙醇之外的药品配好，高压蒸汽灭菌之后加入巯基乙醇)。B.1.5酚/氯仿/异戊醇：25：24：1。B.1.6TE缓冲液1:lmol/LTris-HC15mL，0.5mol/LEDTA1mL，加HCI调pH至8.0，定容至500mL。B.1.7TE缓冲液2:lmol/LTris-HC15rnL，0.5mol/LEDTA1mL，0.5mol/LHCI100mL，定容至500mL。B.1.85mol/LNaCI溶液:146g固体NaCI溶于水中，加水定容至500mL。B.2PCR扩增溶液的配制B.2.1dNTP:用超纯水分别配制A、G、C、T终浓度100mmol/L的储存液。各取20μL混合，用超纯720μL定容至终浓度2.5mmol/Leach的工作液。也可直接购买浓度2.5mmol/Leach的工作液。B.2.2SSR引物：用超纯水分别配制前引物和后引物终浓度均40μmol/L的储存液，等体积混合成20μmo1/L的工作液。注:干粉配制前应首先快速离心。B.2.36×加样缓冲液:去离子甲酞胺49mL，0.5mol/L的EDTA溶液(pH8.0)1mL，澳酚兰0.125g，二甲苯青0.125g。B.3变性聚丙烯酞胺凝胶电泳溶液的配制B.3.140%PAGE胶:丙烯酞胺190g和甲叉双丙烯酚胺10g,定容至500mL。B.3.24.5%PAGE胶::尿素450g，10×TBE缓冲液100mL，40%PAGE胶112.5mL，定容至1000mL。B.3.3Bind缓冲液:49.75mL无水乙醇和250μL冰醋酸，加水定容至50mL。DB13/T1567—20128B.3.4亲和硅烷工作液:在1mLBind缓冲液中加入5μLBind原液，混匀。B.3.5剥离硅烷工作液:2%二甲基二氯硅烷。B.3.625%过硫酸铵溶液:0.25g过硫酸铵溶于1mL超纯水中。B.3.710×TBE缓冲液:Tris碱108g，硼酸55g，0.5mol/LEDTA溶液37mL，定容至1000mL。B.3.81×TBE缓冲液:10×TBE缓冲液500mL，加水定容至5000mL。B.4银染溶液的配制B.4.1固定液：100mL冰醋酸，加水定容至1000mL。B.4.2染色液：2g硝酸银，加水定容至1000mL。B.4.3显影液:1000mL蒸馏水中加入30g氧氧化钠和5mL甲醛。DB13/T1567—20129CC附录C（规范性附录）基本核心引物名单C.1基本核心引物名单见表C.1。表C.1基本核心引物名单标记位点染色推荐正向引物序列（5’-3’）反向引物序列（5’-3’）Vchr1a1ITTCATACCTTGCAGGGAGCTATGATTTCCATTCCCAAATTCAVchr2b2ICCTCCTGCGAACAAGTCTGTGTTGCTGGATTTGTGGAAGGVchr3a3ICAATCATATGAGCAAGGCATGTGCTTCCTGAA