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ICS65.150B51DB37山东省地方标准DB37/T2307—2013长蛸(种质)SpeciesidentificationofOctopusminor2013-04-01发布2013-05-01实施山东省质量技术监督局发布DB37/T2307—2013I前 言本标准按GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准由山东省海洋与渔业厅提出。本标准由山东省渔业标准化技术委员会归口。本标准负责起草单位：马山集团有限公司、中国海洋大学。本标准主要起草人：郑小东、王培亮、李琪、李开锋、钱耀森、于瑞海、左仔荣、常忠岳、崔玉龙。DB37/T2307—20131长蛸(种质)1范围本标准规定了长蛸(Octopusminor(Sasaki,1920))的名称与分类、主要生物学性状、生长与繁殖、遗传特性及检测方法。本标准适用于长蛸种质检测与鉴定。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T18654.2养殖鱼类种质检验第2部分:抽样方法GB/T18654.13养殖鱼类种质检验第13部分：同工酶电泳分析3名称与分类3.1学名长蛸Octopusminor(Sasaki,1920),Octopusvariabilis(Sasaki,1929)为其同物异名。3.2分类软体动物门（Mollusca），头足纲（Cephalopoda），八腕目（Octopoda），蛸科（Octopodidae），蛸属（Octopus）。4主要生物学性状4.1外部形态特征4.1.1外形胴体长卵形，胴长约为胴宽的2倍；体表光滑，具极细的色素色斑。长腕型，腕长约为胴长的6-7倍，各腕长度不等，第一对腕最长也最粗，其腕径约为其他腕径的两倍，腕式为1＞2＞3＞4，腕吸盘两行，基部为一行。雄性右侧第3腕茎化，甚短，仅约为左侧对应腕长度的二分之一；端器匙形，大而明显，约为全腕长度的六分之一。长蛸外部形态见图1DB37/T2307—20132图1长蛸外部形态4.1.2可数性状4.1.2.1腕式:1＞2＞3＞44.1.2.2齿式：3·1·34.2内部构造特征口球内具颚片和齿舌,齿舌的中央齿为五尖型，第一侧齿甚小，齿尖居中，第2侧齿基部边缘较平，齿尖略偏一侧，第3侧齿近似弯刀状,边缘齿外侧具有发达的缘板结构。雄性的阴茎略呈“6”字形，膨胀部卷成螺旋状，阴茎部较短。漏斗器W型。半鳃片数约9～10个。5生长与繁殖特性5.1生长生长迅速，半年全长可到200mm，第二年春季一般可达300mm～400mm。5.2繁殖5.2.1一年性成熟，繁殖期间有短距离洄游。5.2.2产卵习性:性腺一年成熟一次，卵分批产出，卵子长茄型，长径13mm～20mm，短径4mm～6mm。5.2.3繁殖水温:20℃～26℃，最适水温22℃～24℃。5.2.4怀卵量:全长540mm～560mm雌体，怀卵量80～140个左右。6遗传特性6.1同工酶特性同工酶G3PD、AAT和SOD酶谱见图2～图4DB37/T2307—20133图2长蛸同工酶G3PD酶谱图3长蛸同工酶AAT酶谱图4长蛸同工酶SOD酶谱6.2微卫星DNA分子检测特征微卫星DNA分子检测特征见图5、图6图5引物OM07扩增长蛸肌肉组织DNA的凝胶电泳图谱图6引物OM09扩增长蛸肌肉组织DNA的凝胶电泳图谱7检测方法7.1抽样方法参照GB/T18654.2的规定执行。7.2同工酶分析7.2.1凝胶缓冲液和电泳缓冲液的制备凝胶缓冲液见附录A，电泳缓冲液见附录B。DB37/T2307—201347.2.2分析样品的制备电泳前取0.3g样品放入1.5ml离心管，加入等体积的提取液后置于冰浴中研磨，研磨混合液置于冷冻离心机中，在4℃、12000rpm的条件下离心直至上清液澄清，取上清液冷冻保存备电泳用。7.2.3凝胶制备加淀粉30g和制胶缓冲液254ml，在三角烧瓶内混匀，加热至沸腾，抽气，然后注入制胶模具中，冷却后，保鲜膜密封保存备用。7.2.4电泳步骤用手术刀在凝胶距离边三分之一（约2.5cm）处切开，用适当大小的滤纸片蘸取样品提取液放入切口中。上样完毕后，用滤纸搭盐桥，在4℃条件下以40mA稳流进行电泳，电泳时间依酶的种类而不同。7.2.5染色、固定电泳结束后，用割胶弓将凝胶水平切割为1.3mm厚的薄片，置于染色盒中，将配制好的染色液倒入染色盒后置于37℃的恒温箱中进行染色。待酶显示足够的活性后，用10%的冰醋酸溶液终止反应。各种酶的染色液见附录C和附录D。7.2.6制干胶片取凝胶放于大小合适的玻璃纸上，压制封膜，风干，编号保存。7.2.7摄影、扫描用近焦镜头对凝胶及其谱带照相，或用扫描仪对干胶片电泳谱带进行扫描。7.2.8结果分析判定按GB/T18654.13的规定执行。7.3微卫星DNA分析7.3.1基因组DNA的提取取长蛸肌肉0.1g，切碎至糜状，加入500μlCTAB裂解液，加入20μlproteinK酶，混合入1.5ml的离心管，55℃裂解过夜。7.3.2引物序列引物序列见表1表1引物序列OM07-RCTACCTTCCCTAACCTCTCACTAOM07-FCTAGGAGTCTGAACAACGTCAAOM09-RGTTGCTAACGTCATGATAACAGCOM09-FCAAATCATCACCACCGACATC7.3.3PCR反应体系DB37/T2307—2013510μl体系组分见表2表210μl体系组分10×bufferMg2+1μlDNTP(2mM)1μlMgcl2(25mM)0.6μlPrimeⅠ(10μM)1μlPrimeⅡ（10μM）1μlr-Taq（5u/μl）0.08μlDNA模板(100ng/μl)1μlH2O4.32μl7.3.4PCR扩增条件94℃预变性3min,94℃变性1min,Ta（OM07：64℃；OM09：56℃）1min，退火30s,72℃延伸30s,38个循环，循环结束后72℃延伸5min。7.3.5聚丙烯凝胶酰胺电泳1000ml的聚丙烯凝胶酰胺胶液配方:尿素(mw60.06)420g，丙烯酰胺57g，N,N-甲叉3g，10×TBE120ml，灭菌双蒸水定容至1000ml。PCR产物用6%的变性PAGE电泳，银染显色，冰醋酸固定，烘干以读取数据。DB37/T2307—20136AA附录A（规范性附录）制胶缓冲液的配制A.1CT-7.0制胶缓冲液三羟甲基氨基甲烷1.09g，用柠檬酸调至pH7.0，蒸馏水定容至1L。A.2CT-8.0制胶缓冲液三羟甲基氨基甲烷1.21g，用柠檬酸调至pH7.0，蒸馏水定容至1L。A.3CAPM-7.0制胶缓冲液柠檬酸0.42g，用3-氨甲基-吗啡啉调至pH7.0，蒸馏水定容至1L。DB37/T2307—20137BB附录B（规范性附录）电泳缓冲液配制B.1CT-7.0电泳缓冲液三羟甲基氨基甲烷16.35g，用柠檬酸调至pH7.0，蒸馏水定容至1L。B.2CT-8.0电泳缓冲液三羟甲基氨基甲烷20g，用柠檬酸调至pH8.0，蒸馏水定容至1L。B.3CAPM-7.0电泳缓冲液柠檬酸8.4g，用3-氨甲基-吗啡啉调至pH7.0，蒸馏水定容至1L。DB37/T2307—20138CC附录C（规范性附录）染色缓冲液配制C.10.2MTris-HCl,pH8.0三羟甲基氨基甲烷24.22g，用HCl调至pH8.0，蒸馏水稀释至1L。C.20.2MTris-HCl,pH8.5三羟甲基氨基甲烷24.22g，用HCl调至pH8.5，蒸馏水稀释至1L。C.30.1M磷酸缓冲液，pH7.0磷酸氢二钠17.91g和磷酸二氢钠8.05g，溶解定容至1L。DDB37/T2307—20139DE附录D（资料性附录）几种常见同工酶的染色液配制方法同工酶英文名和缩写试剂浓度用量甘油醛-3-磷酸脱氢酶Glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenaseG3PDHa-Glycerolphosphate200mgTris-HCl0.2mol/LpH8.525mlNAD基本保存溶液0.25%25mlPMS基本保存溶液0.5%0.5ml苹果酸脱氢酶MalatedehydrogenateMDH苹果酸250mgTris-HCl0.2mol/LpH9.525mlNAD基本保存溶液0.25%25mlPMS基本保存溶液0.5%0.5ml乳酸脱氢酶LactatedehydrogenaseLDH乳酸锂0.6mlTris-HCl0.2mol/LpH8.525mlNAD基本保存溶液0.25%25mlPMS基本保存溶液0.5%0.5ml超氧物歧化酶SuperoxidedismutaseSOD氯化硝基四氮唑兰10mg乙二胺四乙酸二钠盐100mgTris-HCl0.2mol/LpH9.525ml乙醇2.5mlPMS基本保存溶液0.5%0.5ml蒸馏水20ml酯酶EsteraseEST丙酮1ml固牢RR盐32mg磷酸缓冲液0.1mol/LpH7.020ml.乙醇2mlα-萘乙酸1%20ml苹果酸酶MalicenzymeME苹果酸250mgTris-HCl0.2mol/LpH8.525mlMgCl21mol/L1mlNADP基本保存溶液0.25%25mlPMS基本保存溶液0.5%0.5mlTris-HCl0.2mol/LpH8.025mlNAD基本保存溶液0.25%25mlPMS基本保存溶液0.5%0.5ml_________________________________