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ICS65.150B51DB21辽宁省地方标准DB21/T2209—2013海绵种属分子生物学鉴定技术规程TechnicalSpecificationofIdentifyingSpongethroughMolecularBiologyTechniques2013-12-12发布2014-01-22实施辽宁省质量技术监督局发布DB21/T2209—2013I前言本标准是按照GB/T1.1—2009给出的规则起草的。本标准由大连海洋大学提出。本标准由大连市质量技术监督局归口。本标准主要起草单位：大连海洋大学、中国科学院大连化学物理研究所本标准主要起草人：付晚涛、郑长波、曹旭鹏、苏延明、宋悦凡、潘勍宇、安宗福。本标准于2013年**月**日首次发布。DB21/T2209—20131海绵种属分子生物学鉴定技术规程1范围本标准规定了海绵种属分子生物学鉴定的总则、海绵样品采集与保存、海绵种属鉴定方法。本标准适用于海绵的样品采集、保存、处理和种属分子生物学鉴定方法。2术语和定义下列术语和定义适用于本文件。2.1海绵海绵（Sponge）是最低等多细胞动物（Metazoan），在动物界中单独构成多孔动物门（PhylumPorifera）。2.2海绵分子条码海绵的细胞色素氧化酶亚基Ⅰ（cytochromeoxidasesubunitⅠ，简称COI）的DNA序列为海绵的保守基因序列信息，作为海绵分子条码。3总则3.1原理海绵细胞色素氧化酶亚基Ⅰ（COI）的DNA序列为海绵的保守基因序列，作为海绵分子条码，用于鉴定海绵种属。通过分子生物学技术——聚合酶链式反应（PolymeraseChainReaction，简称PCR）扩增海绵的COI基因部分序列，测序后与已经鉴定海绵的COI基因序列比对，以此鉴定海绵的种属。3.2仪器与设备——野外生物样品保存箱或泡沫保温箱；——高速低温冷冻离心机；——普通PCR仪；——水浴锅；——-80℃冰柜。3.3试剂与材料——无水乙醇（分析纯）；——液氮；——细胞裂解缓冲液（10mmol/LTris-Cl，pH8.0；1mmol/LEDTA，pH8.0；0.1%(m/V)SDS）；——异丙醇（分析纯）；DB21/T2209—20132——醋酸甲溶液（60ml5mol/L醋酸钾；11.5ml冰醋酸；28.5ml超纯水）；——细胞裂解液（20mmol/LTris-Cl，pH7.6）；——蛋白酶K（20mg/ml）；——TE缓冲液（pH7.6）（100mol/LTris-Cl，pH7.6；10mmol/LEDTA，pH8.0）；——超纯水；——PCR酶(5U/μL)；——10×PCR缓冲液（500mmol/LKCl；100mmol/LTris-Cl，pH8.3；15mmol/LMgCl2，在1.05kg/cm2高压灭菌10min）。4海绵样品采集与保存4.1对于潮间带海绵，在海水退潮后，先拍照或摄像，再用金属或木质的小板采集海绵样品于塑料采样瓶中，立刻加入75%乙醇浸没海绵样品并超过2cm以上，然后放入装有冰袋的泡沫保温箱或野外生物样品保存箱，用于分子生物学鉴定。4.2对于潮下带海绵和深海海绵，采样器采集海绵后放入塑料采样瓶中并在瓶中装满样品附近的海水。装有海绵样品和海水的样品瓶被带上船或带上岸后，倒掉采样瓶中海水，立刻加入75%乙醇浸没海绵样品并超过2cm以上，然后放入装有冰袋的泡沫保温箱或野外样品保存箱，用于分子生物学鉴定。4.3上述样品均可在4℃条件下保存1天。4.4海绵样品采集与保存记录于《海绵资源调查采样表》（详见附录A）。5海绵种属鉴定方法以海绵的COI基因序列为鉴定海绵种属的分子生物学信息。5.1海绵DNA提取与纯化5.1.1取约0.5g保存在乙醇中的海绵样品，放入事先用液氮冷却过的研钵中，加入液氮研磨海绵样品成粉末状。5.1.2将研磨成粉末的海绵样品移入装有600μL细胞裂解缓冲液的聚丙烯离心管中混匀，加入3μL蛋白酶K，在55℃水浴锅上放置3h以上。5.1.3从水浴锅取下装有海绵的离心管，放置室温后，加入200μL醋酸钾溶液，振荡、混匀。5.1.4在4℃离心（12,000rpm）3min,将上清液转移至装有600μL异丙醇的新的聚丙烯离心管中，振荡、混匀，然后在室温离心（12,000rpm）3min。5.1.5吸去上清液，加入600μL乙醇（70%），振荡混匀，在室温离心（12,000rpm）3min（重复此过程一次）。5.1.6吸去上清液，在空气中干燥DNA沉淀15min；将DNA沉淀溶解于300μLTE缓冲液（pH7.6），作为海绵基因组DNA提取纯化液。5.1.7海绵基因组DNA提取纯化液保存于-80℃。5.2海绵COI基因序列片段的PCR扩增与测序DB21/T2209—201335.2.1使用扩增海绵COI基因序列片段的特异引物对（LCO1490:GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG；COX1-R1:TGTTGRGGGAAAAARGTTAAATT）。5.2.2在100μLPCR反映管中加入如下试剂：10×PCR缓冲液10μL、引物LCO1490（20pmol/L）0.5μL、引物COX1-R1（20pmol/L）0.5μL、海绵基因组DNA提取纯化液10μL、Taq酶(5U/μL)0.5μL、超纯水定容至50μL。5.2.3把此PCR反应管放在普通PCR仪中，并按照如下条件在进行PCR扩增海绵COI基因序列片段的反应：一个循环反应（94℃2min、50℃1min、72℃2min），30个循环反应（94℃50秒、50℃50秒、72℃2min），最后在72℃停留10min，结束PCR反应。5.2.4从PCR仪中取出扩增的海绵基因片段产品，经测序后获得海绵COI基因片段DNA序列信息。5.3海绵分子生物学种属鉴定5.3.1新测序的海绵COI基因DNA片段序列在在线网站（）进行核苷酸（nucleotide）序列比对，初步获知海绵种属信息；5.3.2根据初步获得的海绵种属信息，根据国际公认的已鉴定海绵COI基因DNA片段序列信息（在线网站：）确认海绵种属，COI基因DNA片段序列一致性不低于99%的海绵被鉴定为同一种属海绵，记下种属名，记录于《海绵分子生物学鉴定记录表》（详见附录B）。5.3.3对于海绵COI基因DNA片段序列一致性低于99%的海绵，作为暂时不能鉴定海绵，记录于《暂时不能鉴定海绵的记录表》（详见附录C）。ADB21/T2209—20134AB附录A（资料性附录）海绵资源调查采样表海区船名航次；采样点经度纬度；采样时间年月日时分至年月日时分采样人；水深水温盐度；序号标本瓶号海绵样品记录名称数量备注1234567记事：采样记录校对DB21/T2209—20135BC附录B（资料性附录）海绵分子生物学鉴定记录表鉴定人；地点；时间年月日时分至年月日时分分子生物学仪器的名称型号；序号标本瓶号海绵样品记录名称海绵分子生物学鉴定结果备注123456789记事：采样记录校对DDB21/T2209—20136附录C（资料性附录）暂时不能鉴定海绵记录表分子生物学鉴定人；地点；时间年月日时分至年月日时分序号标本瓶号海绵样品记录名称海绵的暂时不能鉴定结果备注1234567记事：采样记录校对