DB32∕T 2390-2013 蔬菜作物种子遗传纯度DNA分子检测技术规程

ICS65.020.01B61备案号：41075-2014DB32江苏省地方标准DB32/T2390—2013蔬菜作物种子遗传纯度DNA分子检测技术规程TechnicalrulesforseedgeneticpuritytestingofvegetablecropwithDNAmolecularmarkers2013–12–30发布2014–01–20实施江苏省质量技术监督局发布DB32/T2390—2013I前言为了规范蔬菜作物种子遗传纯度的DNA分子检测，确保检测结果准确可信，特制定本标准。本标准按按照GB/T1.1-2009《标准化工作导则第1部分：标准的结构和编写》的规定编写。本标准由南京农业大学提出。本标准起草单位：南京农业大学。本标准主要起草人：柳李旺、龚义勤、吴志行、王燕、徐良。DB32/T2390—20131蔬菜作物种子遗传纯度DNA分子检测技术规程1范围本标准规定了蔬菜作物种子遗传纯度的DNA分子检测方法。本标准适用于番茄、甘蓝、花椰菜、黄瓜、西（甜）瓜、辣椒、萝卜等重要蔬菜优良F1杂交种品种种子遗传纯度鉴定。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T3543.1-1995农作物种子检验规程总则GB/T3543.2-1995农作物种子检验规程扦样GB/T3543.4-1995农作物种子检验规程发芽试验GB/T3543.5-1995农作物种子检验规程真实性和品种纯度GB/T19557.1植物新品种特异性、一致性和稳定性测试指南总则GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB16715.3-2010瓜菜作物种子茄果类GB16715.1-2010瓜菜作物种子瓜类GB16715.4-2010瓜菜作物种子甘蓝类3术语和定义下列术语和定义适用于本标准。3.1遗传纯度(Geneticpurity)品种在特征特性方面典型一致的程度，用本品种的种子数占供检本作物样品种子数的百分率表示。3.2异型株(Off-type)（杂株、变异株）一个或多个性状(特征特性)与原品种育成者所描述的性状明显不同的植株。3.3聚合酶链式反应(PCR，PolymeraseChainReaction)一种在体外快速扩增DNA序列的技术。模板DNA经高温变性为单链，在DNA聚合酶和适宜温度DB32/T2390—20132下，两条引物分别与DNA模板两条链上的一段特异互补序列发生退火，并在DNA聚合酶催化下以4种dNTPs(脱氧核苷三磷酸）为底物，使退火引物延伸从而合成DNA；经过类似的变性、退火和延伸，30-45个循环后，使得位于引物结合位点序列之间的DNA片段呈几何级数递增。3.4引物(Primer)具有游离的3’-OH末端及特定序列的寡核苷酸短片段，与DNA模板结合后启动PCR反应。3.5分子标记(Molecularmarker)指以DNA为基础、可遗传的标记。在遗传研究中使用的分子标记技术大体分为三大类：1）以分子杂交为基础的DNA标记技术，主要有限制性片段长度多态性标记（RFLP标记）；2）以PCR为基础的各种DNA标记技术，主要为随机扩增多态性DNA标记（RandomamplificationpolymorphismDNA，简称RAPD标记），简单重复序列间区域标记(Inter-simplesequencerepeatspolymorphisms，简称ISSR标记)，扩增片段长度多态性（Amplifiedfragmentlengthpolymorphisms，简称AFLP）标记，简单序列重复标记（Simplesequencerepeats，简称SSR标记）以及SRAP(Sequence-relatedamplifiedpolymorphism)等；3）一些新型分子标记，如单核苷酸多态性(简称SNP),表达序列标签(简称EST)等。目前应用于种子纯度检测与分子育种的标记主要有RAPD、SSR、SRAP、ISSR、AFLP等。3.6有效特征引物（Specificeffectiveprimer）指能够在亲本间产生多态性条带（即检测到多态性位点）、且能够稳定遗传到F1的特定引物，可以用于F1杂交种品种种子遗传纯度鉴定。4原理分子标记技术具有多态性高、遗传稳定、不受环境条件影响等优点。种子遗传纯度分子标记检测是直接针对DNA片段（基因）进行分析，通过检测基因水平上的差异来判断种子的纯度。F1杂交种品种单株间特定DNA（基因）位点的差异有无是判断种子遗传纯度的重要标准。获得有效特征引物是进行F1杂交种品种种子遗传纯度鉴定的核心。利用这些有效特征引物就可以检测F1杂交种品种单株间特定DNA（基因）位点的差异，最终鉴定出供检种子遗传纯度。5测定程序5.1送验样品扦样《农作物种子检验规程扦样》要求。从供检样品中随机取200粒种子按GB/T3543.4《农作物种子检验规程发芽试验》标准中规定的方法进行发芽，从发芽的幼苗中随机取不少于100株进行检测。5.2样品基因组DNA提取按附录B步骤进行。样品基因组DNA的OD260/OD280值要求在1.8左右。DB32/T2390—201335.3有效特征引物筛选与扩增反应体系有效特征引物获得需要通过选取亲本双亲DNA，通过RAPD、SSR或SRAP-PCR扩增，进行亲本间多态性条带（即多态性位点）筛选，初步确定某些特定引物；再进一步利用杂交种品种部分单株来检测这些特定引物产生的标记是否能够稳定遗传；那些能够在亲本间产生多态性条带、且能够稳定遗传到F1的特定引物即为有效特征引物。有效特征引物中，采用1-2个可产生共显性标记的引物（即在F1中能够同时产生父、母本特异标记的引物）对供检样品进行检测。RAPD、SSR和SRAP-PCR按以下反应体系加样：5.3.1RAPD反应体系（以总体积18.0μL计）表1RAPD反应体系序号反应体系组分原液反应体系应加量(μL)最终浓度110PCRbuffer(缓冲液)1.8/225mmol.L-1Mg2+1.442.0mM310mmol.L-1dNTPs0.270.15mM4引物(10μM)0.80.44μM5Taq酶(5U/μl)0.150.75U6模板DNA(20ng/μl)1.020.0ng7ddH2O(灭菌双蒸水)12.54/8总体积(μL)18.0/5.3.2SSR反应体系（以总体积16.0μL计）表2SSR反应体系序号反应体系组分原液反应体系应加量(μL)最终浓度110PCRbuffer(缓冲液)1.6/225mmol.L-1Mg2+1.282.0mM310mmol.L-1dNTPs0.320.2mM4正向引物(10μM)0.40.25μM5反向引物(10μM)0.40.25μM6Taq酶(5U/μl)0.160.8U7模板DNA(20ng/μl)1.020.0ng8ddH2O(灭菌双蒸水)10.84/9总体积(μL)16.0/5.3.3SRAP反应体系（以总体积16.0μL计）DB32/T2390—20134表3SRAP反应体系序号反应体系组分原液SRAP反应体系应加量(μL)最终浓度110PCRbuffer(10PCR缓冲液)1.6/225mmol.L-1Mg2+1.923.0mM310mmol.L-1dNTPs0.320.2mM4正向引物(10μM)0.40.25μM反向引物(10μM)0.40.25μM5Taq酶(5U/μl)0.160.8U6模板DNA(20ng/μl)1.020.0ng7ddH2O(灭菌双蒸水)10.2/8总体积(μL)16.0/5.4扩增反应程序在基因扩增仪中扩增。RAPD-PCR反应程序为：94℃预变性2min;94℃变性30s,37℃退火45s，72℃延伸1.5min，共40个循环；最后，72℃延伸10min，4℃保存。SSR-PCR程序为：94℃预变性2min；94℃变性45s，52-60℃（根据不同SSR引物Tm值）退火45s，72℃延伸60s，共32个循环；72℃延伸7min,4℃保存。SRAP-PCR程序为：94℃预变性3min；94℃变性1min，35℃退火1min，72℃延伸90s，共5个循环；94℃变性1min，50℃退火1min，72℃延伸90s，共33个循环；最后，72℃延伸7min,4℃保存。5.5扩增产物检测5.5.1RAPD检测扩增反应完毕的DNA样品中加入4μl加样缓冲液（含0.25%溴酚蓝、30%蔗糖），取18μL扩增产物于1.2%琼脂糖胶上电泳，采用1倍TAE电泳缓冲液，120V恒压条件下电泳40-50min；EB染色后利用凝胶成像系统拍照，记录结果，保存。5.5.2SSR、SRAP检测扩增反应完毕的DNA样品中加入3μl加样缓冲液，取扩增产物3.5μL采用双垂直板非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE），凝胶浓度8%；预电泳50-60V30min后上样，120V电泳2.0-2.5h；凝胶采用0.5%冰醋酸、10%乙醇固定液固定12-20min；0.2%AgNO3溶液染色15min；蒸馏水洗涤两次后于显影液（1.5%NaOH，0.4%甲醛，0.002%Na2S2O3）中显影；银染检测后，进行图片扫描或照相保存与记载。6结果计算和表示对F1杂种幼苗基因组DNA扩增产物进行电泳分析，根据有效特征引物产生的目标标记条带来判别真、假杂种。只有同时具有父、母本特异性标记条带的幼苗单株判定为真正的杂交种，将仅具有母本特异性标记条带或仅具有父本特异性标记条带的幼苗单株判定为假杂种。种子鉴定用本品种纯度百分率表示。根据分子标记有效特征引物分析结果，计数供检样品幼苗株数和非本品种幼苗株数，并按下列公式计算供检种子遗传纯度（%）：DB32/T2390—20135供检种子粒数(幼苗数)-异型株种子粒数(幼苗数)品种纯度(%)＝×100供检种子粒数(幼苗数)7结果报告检验结束后，应填报种子遗传纯度分子检验结果报告单(见附录C)。所测定的结果须填报种子数、幼苗数或植株数。品种种子遗传纯度是否达到国家规定的种子质量要求，可参照国标GB16715-2010、GB8079-1987进行判别。_________________________________