DB11T 1053.2-2013 实验用鱼 第2部分寄生虫学等级及监测

ICS65.020.30B44备案号:40367-2014DB11北京市地方标准DB11/T1053.2—2013实验用鱼第2部分：寄生虫学等级及监测LaboratoryfishPart2：Parasitologicalstandardsandmonitoring2013-12-20发布2014-04-01实施北京市质量技术监督局发布DB11/T1053.2—2013I目次前言.................................................................................II1范围...............................................................................12规范性引用文件.....................................................................13术语和定义.........................................................................14寄生虫学等级分类...................................................................15检测项目...........................................................................16检测程序...........................................................................27检测要求...........................................................................38检测方法...........................................................................49结果判定...........................................................................4附录A（规范性附录）实验用鱼的寄生虫学检测方法......................................5附录B（规范性附录）寄生虫的染色法和玻片标本制备方法................................6附录C（规范性附录）实验用鱼寄生虫的形态、症状和检测方法............................8DB11/T1053.2—2013II前言DB11/T1053的本部分按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。DB11/T1053《实验用鱼》分为六个部分：——第1部分：微生物学等级及监测；——第2部分：寄生虫学等级及监测；——第3部分：遗传质量控制；——第4部分：病理学诊断规范；——第5部分：配合饲料技术要求；——第6部分：环境条件。本部分为DB11/T1053的第2部分。本部分由北京市科学技术委员会提出。本部分由北京市科学技术委员会归口。本部分由北京市科学技术委员会组织实施。本部分起草单位：中国科学院水生生物研究所、国家人口计生委科学技术研究所。本部分主要起草人：王桂堂、李文祥、崔宗斌、孙德明。DB11/T1053.2—20131实验用鱼第2部分：寄生虫学等级及监测1范围DB11/T1053的本部分规定了实验用鱼（斑马鱼和剑尾鱼）的寄生虫学等级和监测标准，包括：寄生虫学的等级分类规定、检测要求、检测程序、检测方法、结果判定等要求。本部分适用于实验用鱼（斑马鱼和剑尾鱼）寄生虫学等级分类和质量监测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。DB11/T196常见鱼病防治技术操作规程3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1实验用鱼laboratoryfish经人工饲养、繁育，对其携带的病原微生物及寄生虫实行控制，遗传背景明确或者来源清楚，用于科学研究、教学、生产、检定以及其他科学实验的鱼类。4寄生虫学等级分类4.1普通级实验用鱼conventional(CV)laboratoryfish不携带所规定的鱼的烈性传染病病原和与人共患病的病原。4.2无特定病原体级实验用鱼specificpathogenfree(SPF)laboratoryfish除了普通级应排除的病原体外，不携带所规定的对实验用鱼危害大、重要潜在感染或条件致病和对科学实验干扰大的病原体。5检测项目5.1外观检查外观健康、无异常。DB11/T1053.2—201325.2寄生虫学检查寄生虫学等级及检测项目见表1。表1寄生虫学等级及检测项目等级应排除的寄生虫病原体检测要求无特定病原体级普通级原虫Protozoan微孢子虫Pseudolomaneurophilia卵圆鞭毛虫Piscinoodiniumpillulare多子小瓜虫Ichthyophthiriusmultifiliis寄生蠕虫Helminth头槽绦虫Bothriocephalidae●●●○原虫Protozoan斜管虫Chilodonella车轮虫Trichodina杯体虫Apiosoma粘孢子虫Myxozoan寄生蠕虫Helminth指环虫Dactylogyrus绒毛伪毛细线虫Pseudocapillariatomentosa三代虫Gyrodactylus驼形线虫Camallanidae寄生性甲壳动物Crustacean锚头鳋Lernaea●●○○●●○○○注：●必须检测项目：指在进行实验用鱼质量评价时必须检测的项目。○必要时检测项目：指引进实验用鱼时或怀疑本病流行等必要时要求检测的项目。6检测程序检测程序见图1。DB11/T1053.2—20133抽样↓编号↓外观检查↓麻醉↓体外寄生虫学检查和取材↓剖检及体内寄生虫学检查和取材↓解剖镜和显微镜检查-----必要时取水样↓寄生虫学鉴定↓检测结果↓检测报告图1检测程序7检测要求7.1检测频率常规性监测：普通级和无特定病原体级实验用鱼种群每3个月至少检查一次。其他检测：需要时进行。7.2采样要求7.2.1采样对象常规性监测，选择3月龄以上的成鱼。7.2.2采样方式按照DB11/T196执行。应在每一生产、实验设施内隔离的不同水环境内随机抽取样本鱼。病理样品的采集应与微生物学、寄生虫学检测联合进行。7.2.3采样数量抽样采集数量见表2。DB11/T1053.2—20134表2抽样采集数量同一水环境实验用鱼数量抽样数量100尾以下5尾100尾以上5%，最大取样量为30尾7.2.4样本送检及运输样本送检运输容器应清洁卫生，防止样本腐败或污染。样本应有特定编号和标识并附送检单，写明样本的来源、种、系、级别、数量、检测项目和采样时间。8检测方法寄生虫的检测方法按附录A、B、C的规定分项进行检测。9结果判定9.1合格判定每个隔离的水环境内所有样品的微生物学指标都符合该等级标准要求，则判定该水环境内的实验用鱼群为合格。9.2不合格判定每个隔离的水环境内如有一个样品的微生物学指标不符合该等级标准要求，则判定该水环境内的实验用鱼群为不合格。ADB11/T1053.2—20135附录A（规范性附录）实验用鱼的寄生虫学检测方法A.1体外寄生虫的检测方法A.1.1肉眼检查A.1.1.1将待检鱼放在解剖盘上，肉眼检查鳞片和鳍条上有无白色包囊和寄生虫存在。A.1.1.2体表检查之后，将鳃盖掀起，注意鳃的色泽，粘液的多少，有无白点，鳃有无肿大，鳃丝末端是否肿大发白及是否有异物存在等变化。A.1.2镜检A.1.2.1鳞片和鳍条：采用水浸片法，即用解剖刀或镊子刮取鳞片和鳍条上的粘液，放于载玻片上，加一滴清水或生理盐水，用镊子将组织分散，加上盖玻片，在体视显微镜下观察。A.1.2.2鳃：先用剪刀将左右两边的鳃完整地取出，放在培养皿里。在每边鳃的第一片鳃片接近两端的位置用小剪刀取一小块鳃丝，放在载玻片上，加上少量清水，盖上盖玻片，在显微镜下检查。然后将鳃小片逐片剪开，在体视显微镜下用两根解剖针，把鳃丝逐条分开，仔细检查，或用镊子将每片鳃片的鳃上所有内含物完全刮下，放在培养皿里，用清水稀释、搅匀后，在解剖镜下进行检查。A.1.2.3检查单殖吸虫时，可用清水洗涤数次，倒弃上清液后在解剖镜下检查。A.2体内寄生虫的检测方法A.2.1根据部位和组织采用不同的方法检查体内寄生虫。A.2.2眼球：采用水浸法，即将鱼体的眼球取下，放在盛有生理盐水的培养皿中，待寄生虫游离出来后，即可在体视显微镜下观察。A.2.3体腔、脏器、生殖腺和鳔：首先采用肉眼观察，看组织表面有没有肉眼可见的白色包囊和寄生虫；然后将体腔用生理盐水冲洗，并盛在培养皿中，其他组织用生理盐水浸泡在培养皿中，待寄生虫游离出来后，便可在体视显微镜下观察。A.2.4肠道：先用肉眼检查，看肠外壁有无白点，这些白点通常是微孢子虫或粘孢子虫的孢囊。肠道内的寄生虫检测采用压片法，先把肠外壁上的脂肪组织尽量除干净，否则脂肪会混进肠的内含物，妨碍观察。除净脂肪组织后，将肠管前后拉长、剪开，如果内含物不多，用解剖刀将内含物和肠壁上的粘液都刮下来，用两片玻片压成薄片，在解剖镜下直接检查寄生蠕虫；如果肠内含物较多，则应将肠的内含物先取下来，放在培养皿里，用生理盐水冲洗搅匀，在显微镜下检查寄生虫。A.3其它检测方法寄生虫的检测除了活体检测，还可以通过寄生虫标本的简单染色法（附录B）和常规的组织切片法来对寄生虫进行形态鉴定。DB11/T1053.2—20136附录B（规范性附录）寄生虫的染色法和玻片标本制备方法B.1原虫的涂片染色法B.1.1把保存在70％酒精里的原虫涂片放到梯度酒精水化，每一阶段5min～6min。B.1.2然后把涂片放进2％的铁明矾溶液中媒染，纤毛虫2h～4h，鞭毛虫和粘孢子虫6h～10h。B.1.3媒染后，用蒸馏水洗2次，每次4min～5min，然后放进海氏苏木精溶液中染色。B.1.4染色的时间：纤毛虫2h～4h，鞭毛虫和粘孢子虫6h～10h。B.1.5染好后取出，用蒸馏水冲洗粘附在玻片上的染料，放入2％的磷钨酸溶液中褪色。在褪色过程中，每隔一定时间要放在显微镜下观察，当核成紫蓝色，细胞质为浅灰蓝色，纤毛和鞭毛都看得见，即可，褪色时间大约6h～8h。这时把涂片从染色缸中取出，涂面朝上，放在盛有自来水的培养皿中，用微流水冲洗0.5h，然后用梯度酒精脱水，每一阶段5min，但在95％和无水酒精中的时间为10min，然后移至二甲苯，透明10min。B.1.6最后把已透明的涂片放在滴有加拿大树胶的清洁载玻片上，封固，贴上标签。B.2吸虫、绦虫、棘头虫的整体染色法B.2.1把保存在70％酒精里的标本（挑选压得平整、姿态正常的）放到梯度酒精水化，每一阶段10min～15min，然后用爱氏苏木精染色。B.2.2把蒸馏水洗过的虫体放进染色液中，经1h～3h（视虫体大小而定）后，水洗；如染色太深，可放在1％酸酒精（1%盐酸乙醇液：盐酸1份+70%乙醇100份）中褪色。在褪色过程中，要时常在体视显微镜下观察，当虫体体壁呈现为浅灰蓝色，内部器官为紫蓝色时就可以中止褪色处理。B.2.3褪色好的标本用微流水冲洗至少1h（或多次换水），然后用梯度酒精脱水，每一阶段停留10min～15min。在95％和无水酒精两阶段，都必须更换一次酒精，时间也要延长一些。再从1/2无水酒精＋1/2二甲苯接着移至纯二甲苯中，时间相同，使虫体透明，然后用镊子或干燥吸管取虫体，放在滴有加拿大树胶的载玻片上，用针将虫体拨正，盖上盖玻片。B.3几种不需要染色的寄生虫处理方法B.3.1具有几丁质的甲壳类、单殖吸虫和棘头虫把固定的标本取出，放在载玻片上，用