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ICS65.020.99B22备案号：40456-2014江苏省地方标准DB32DB32/T2570-2013鸡传染性法氏囊RT-LAMP诊断技术规程TechnicalcodeofdetectingRT-LAMPforInfectiousBursalDisease2013-12-20发布2014-01-20实施江苏省质量技术监督局发布DB32/T2570-2013前言为规范鸡传染性法氏囊RT-LAMP诊断技术规程，提高鸡传染性法氏囊病毒检测的灵敏度、稳定性、特异性，特制定本标准。本标准按GB/T1.1-2009《标准化工作导则第1部分：标准的结构和编写》要求编写。本标准的附录为规范性附录。本标准由江苏省农业科学院提出。本标准起草单位：江苏省农业科学院。本标准起草人：刘宇卓、李银、黄欣梅、赵冬敏、韩凯凯、张敬峰。DB32/T2570-20131鸡传染性法氏囊RT-LAMP诊断技术规程1范围本标准规范了鸡传染性法氏囊RT-LAMP诊断技术规程所用引物、所涉及的样品范围、操作流程、反应条件等技术标准。本标准适用于鸡传染性法氏囊病毒病的实验室诊断、临床诊断、流行病学调查、分离毒株的鉴定。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB16548-2006病害动物和病害动物产品生物安全处理规程NY/T541-2002动物疫病实验室检验采样方法DB13/T500商品肉鸡传染性法氏囊病防治技术规程3主要试剂和仪器3.1DNAMarkerDL-20003.26xLoadingbuffer3.3BstDNAPolymerase3.4MgSO43.5DEPC3.6Betaine3.7lOXThermoPolbuffer3.8异丙醇3.9无水乙醇3.10琼脂糖3.11核酸染料3.12氯仿3.13电泳仪3.14电热恒温水槽4引物按照GenBank上公布的鸡传染性法氏囊病毒（IBDV）A节段的基因序列(GenBankAY444873)，在VP3基因保守区域利用LAMPprimerdesigningsoftwarePrimerExplorer设计一套引物，序列为：F3：5′一CCAACTGGGCGACGTTTA一3′B3：5′一CAGAATGGAACAGTGGGTCC一3′FIP：5′一GTCCTGCATTGGGTGGAAGGTATTTTTTTTCCTCACAATCCACGCG一3′BIP：5′一CTGGCTATGGCCGCTTCAGATTTTTGCTGCTTCCATGGCTCT一3′5临床诊断DB32/T2570-20132按照DB13/T500商品肉鸡传染性法氏囊病防治技术规程中4.1流行特点、4.2临床症状、4.3.1剖检病变进行。6采样和样品的处理6.1病料的采集及处理按照NY/T541-2002动物疫病实验室检验采样方法，病死或扑杀鸡，无菌采集法氏囊及肾脏、肝脏组织，于0～4℃冷藏保存并立即送检，采样过程中样品不得交叉污染。6.2样品的处理剖检取法氏囊及肾脏、肝脏组织，可单独使用，也可混合后使用。取上述病料或经鸡胚接种后的绒毛尿囊膜及胚体，置无菌研钵中剪碎并研磨，-20℃反复冻融三次，将研磨好的组织以4℃12000rpm离心10min，取上清备用。7RT-LAMP7.1RNA的提取取已处理的待检样品，以已知IBDV病毒为阳性对照，以无菌水为阴性对照，每管依次加入Trizol600µL，振荡混匀后，室温放置10min，加入氯仿200µL，剧烈振荡后，室温放置1min，4℃12000rpm，离心15min，取上层水相750µL，加入500µL异丙醇，混匀，-20℃放置15min，4℃10000rpm离心10min，去上清，缓缓加入75%乙醇1mL洗涤，4℃8000rpm离心5min，去上清，室温干燥20min，加入DEPC水10µL，使充分溶解。或使用RNA提取试剂盒进行提取。7.2反应条件FIP引物1.2μL，BIP引物1.2μL、F3引物0.15μL、B3引物0.15μL、BstDNApoLymerase2μL、lOXThermoPolbuffer2.5μL、100mmol/LMgSO41.5μL、8mmol/LBetaine5μL、10mmol/LdNTPs4μL、RNA酶抑制剂0.5μL、RNA模板2μL、反转录酶1.0μL、ddH2O4.8μL，总体积为25μL，瞬间离心混匀。60℃水浴60min，80℃灭活10min，4℃保存。7.3RT-LAMP结果观察及判定下述两种方法任择其一：7.3.1电泳7.3.1.1以阳性IBDV液作为阳性对照，以灭菌水作阴性对照，做RT-LAMP,所有反应产物同时电泳。取RT-LAMP反应产物各8～10μL于1.0%琼脂糖凝胶进行电泳，电压为120V，时间30～40min，紫外灯下观察结果。7.3.1.2在阳性对照有梯状目的条带，阴性对照无条带的情况下，检测样品出现与阳性对照相同梯状条带的判为阳性，即该样品的IBDV核酸呈阳性；检测样品未出现与阳性对照相同目的条带的判为阴性，即该样品为IBDV核酸阴性。如果阳性对照无相应的目的条带，或者阴性对照出现条带，结果均无效，该试验需要重做。7.3.2显色反应7.3.2.1在每个RT-LAMP反应管内加入荧光染料0.5μL，旋涡混匀，肉眼观察颜色变化。7.3.2.2加入核酸染料后5～10min进行显色判定。肉眼观察反应管，当阳性对照管液呈现绿色，阴性对照管液呈现橘黄色时，说明染料正常，显色反应成立，可以进行其它样品的判定，否则，显色反应无效。其它样品，如反应管中液体呈绿色时，该样品即可判定为IBDV核酸阳性，呈橘黄色时判定为IBDV核酸阴性。DB32/T2570-201338结果判定8.1临床诊断的判定当临床上出现与第5条流行病学、临床症状及剖检变化相符的情况，可以初步判定为鸡传染性法氏囊病。8.2实验室RT-LAMP结果的判定同7.3。8.3诊断结果判定如根据流行病学、临床症状及剖检变化可以初步临床诊断为鸡传染性法氏囊病，结合实验室RT-LAMP检测结果，当鸡传染性法氏囊病病毒检测为核酸阳性时，即可将该病例诊断为鸡传染性法氏囊病。DB32/T2570-20131附录A(规范性附录)阳性样品的制备A.1毒株本研究室分离、鉴定并保存的鸡传染性法氏囊病毒毒株。A.2制备取保存毒株，用灭菌生理盐水作1:50～100倍稀释，接种9日龄～10日龄SPF鸡胚尿囊膜，0.2mL/枚。置37℃恒温箱继续培养，每天照蛋观察3次。弃去48h前死亡胚，无菌收获48h～120h死亡胚及尿囊膜，无菌剪碎并研磨，反复冻融三次后，12000g离心10分钟，吸取上清分装到1.5ml离心管中，每管200µL，-20℃保存，备用。