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ICS65.020.20B31备案号：37037-2013江苏省地方标准DB32DB32/T2260-2012甘蓝品种纯度及真实性SSR分子检测方法SSR-basedMethodtoAssayPurityandGenuinenessinCabbage(BrassicaoleraceaL.var.capitataL.)2012-12-28发布2013-02-28实施江苏省质量技术监督局发布DB32/T2260-2012前言本标准按照GB∕T1.1-2009《标准化工作导则第1部分：标准的结构和编写》的规定编写。本标准的附录A为规范性附录，附录B为资料性附录。本标准由江苏省农业科学院提出。本标准由江苏省农业科学院负责起草。本标准主要起草人：曾爱松、严继勇、宋立晓、高兵。DB32/T2260-20121甘蓝品种纯度及真实性SSR分子检测方法1范围本标准依据SSR分子标记原理，规定了进行甘蓝杂交种和亲本自交系的品种纯度及真实性检测方法的仪器设备及试剂、引物筛选、试验步骤、纯度检测和真实性鉴定。本标准适用于甘蓝杂交种及亲本自交系的纯度及真实性检测。2术语和定义下列术语和定义适用于本标准。2.1品种纯度varietalpurity品种在DNA分子标记带型方面典型一致的程度，用供检样品中本品种的种子数占样品种子总数的百分率表示。2.2品种真实性varietalgenuineness供检品种与标准品种在DNA分子标记带型方面的符合程度。2.3SSR分子标记simplesequencerepeatmarker由寡核苷酸为单位的简单串联重复序列。2.4引物primer结合在模板DNA上的互补短链，提供3＇-OH末端作为DNA合成的起点，延伸合成模板DNA的互补链。3原理在甘蓝基因组中普遍存在着由寡核苷酸为基本单位的简单串联重复序列，品种间因其重复次数不同而存在多态性，据此可以利用适宜引物进行PCR扩增，从而检测出特定SSR位点的多态性，以鉴别品种的纯度及真实性。4仪器设备及试剂4.1仪器设备PCR扩增仪；DNA序列分析电泳槽；高压电泳仪（3000V，400mA，400W）；电子天平（感量0.01g，0.001g）；冰箱；微量加样器（0.5μL～10μL，20μL～200μL，100μL～1000μL）；磁力搅拌器；胶片观察灯；水平摇床；高压灭菌锅；酸度计等。DB32/T2260-20122烧杯；镊子；刻刀；量筒；容量瓶（500mL，1000mL）；离心管（0.5mL，1.5mL）；吸头(10μL，200μL，1000μL)；注射器（100mL）；96孔深孔板；96孔PCR板；封板膜；一次性手套；离心管架；染色盒（55cm×38cm×8cm）；水平仪；夹子等。4.2试剂乙二胺四乙酸二钠（EDTA-Na2）；三羟甲基氨基甲烷（Tris）；盐酸（HCl，36%）；氢氧化钠(NaOH)；10倍PCR缓冲液（不含Mg2+），保存条件为-20℃；氯化镁（MgCl2）；四种脱氧核糖核苷酸（dNTPs），保存条件为-20℃；TaqDNA聚合酶（5U/μL），保存条件为-20℃；SSR引物，保存条件为-20℃；矿物油；去离子甲酰胺；溴酚蓝；二甲苯青FF；甲叉双丙烯酰胺；丙烯酰胺；硼酸；尿素；亲和硅烷（BindingSilane）；剥离硅烷（RepelSilane）；无水乙醇；四甲基乙二胺；过硫酸铵；冰醋酸；硝酸银；甲醛溶液等。4.3试剂制备DNA提试剂、PCR反应试剂、电泳试剂和银染试剂的成分及配制按附录A执行。5引物筛选适宜引物筛选应遵守扩增后的杂交种SSR电泳谱带含有双亲谱带，而且带型清晰、重复性好的原则。可以利用已经公开发表的引物，也可以自行筛选引物。自行筛选时，取测试杂交种种子10粒及父母本种子各5粒，利用一系列引物进行分析，从中确定适宜的引物。常见适用于甘蓝品种的纯度及真实性分析的SSR引物名称及序列参见附录B。6方法步骤6.1DNA提取本研究采用CTAB法对材料提取DNA，具体步骤如下：6.1.11.5ml离心管中加入离心管盖大小的叶片2片。6.1.2离心管中加入50μlCTAB，轻轻研磨至浆状，再加入600ulCTAB。6.1.365℃水浴1h，每10min轻摇1次，以避DNA凝成团。6.1.4置于4℃冰箱或室温下冷却至15℃以下。6.1.5加入650μl氯仿：异戊醇(24：1)，上下混匀5min。6.1.612000rpm离心10min。6.1.7吸取上清液450μl，加入预冷的无水乙醇650μl。6.1.84℃放置30min以上。6.1.912000rpm离心10min，弃上清，晾干。6.1.10加入100μl的TE或超纯H2O，每100μl加入0.5μl(2mg/ml)的RNAase，混匀。6.1.1137℃水浴1h。6.1.12琼脂糖凝胶电泳检测DNA的浓度和纯度，取5μl模板原液，在1％琼脂糖胶电泳检测。样品DNA溶液可以直接进行PCR扩增或在冰箱中冷冻长期保存。6.2PCR反应参数6.2.1SSR反应体系SSR反应体系为20μl，各成分加入量如表1。DB32/T2260-20123表1SSR反应体系为20μl成分加入量引物1，110ng/μl0.8μl引物2，10ng/μl0.8μldNTP，2.5mM1.6μl10×Buffer，含MgCl22.0μlTaq酶，2.5U/μl0.4μlddH2O9.4μlDNA，10ng/μl5.0μl6.2.2SSR反应扩增程序94℃4min94℃30s35个循环55℃30s72℃1min72℃7min4℃∞6.3检测6.3.1丙稀酰胺凝胶电泳采用8％丙稀酰胺凝胶电泳进行PCR产物的分离，电压为160V恒压。具体的操作步骤如下：6.3.1.1装板将短板与长板的凹面相对，长板上端和短板下端各留出1cm，装入框内。6.3.1.2封板配制1％琼脂糖封底，放置10min，待彻底凝固。6.3.1.3上板将封好的玻璃板装入电泳槽，以对角线的方向旋转螺母。6.3.1.4灌胶每一板胶均按照以下配方配制，混匀后灌胶，插入梳子。6.3.1.5点样凝固1h后，向电泳槽中加入0.5×TBE缓冲液，将梳子拔出。20μlPCR产物加入5μl的LoadingBuffer(双色)，上样量为3.5μl。6.3.1.6电泳电泳时电压恒定在160V，时间为2h。6.3.2快速银染法电泳结束后进行卸板，在缓冲液中轻轻摇晃直至胶从板上脱离为止，开始以下的银染：6.3.2.1固定DB32/T2260-20124450mlddH2O＋50ml无水乙醇＋2.5ml冰醋酸，固定2次，每次6min。6.3.2.2银染500mlddH2O＋1gAg2NO3，12min。6.3.2.3清洗第一次：500mlddH2O，30s；第二次：500mlddH2O＋120μlNa2S2O3，30s。6.3.2.4显色500mlddH2O＋7.5gNaOH＋1500μl甲醛，8min。6.3.2.5固定用步骤一中的固定液固定2min。6.3.2.6漂洗将胶放置在蒸馏水中漂洗2min；6.3.2.7包装取出后用保鲜膜封好，扫描或照相保存。6.4判断标准结果判断依据第2章中规定的品种纯度及品种真实性的定义判断。7纯度检测7.1取样送检样品不少于1000粒种子。从送检样品中随机取不少于100粒种子。7.2SSR分析按照本标准第6章规定的方法步骤进行。7.3数据计算和表示品种纯度%（自交系）=（供检种子粒数－非本品种种子粒数）/供检种子粒数×100品种纯度%（杂交种）=（供检种子粒数－母本种子粒数－父本种子粒数）/供检种子粒数×1007.4结果判断根据计算出的品种纯度%判断出相应的甘蓝品种纯度。8真实性鉴定8.1取样分别从送检样品和标准样品中各随机抽取10粒种子。8.2SSR分析利用筛选出的若干对SSR核心引物，按照本标准第6章规定的方法步骤进行。对样本间存在差异的引物和样本内个体之间存在差异的引物，从送检样品和标准样品中分别重新取样进行复检。DB32/T2260-201258.3结果判定送检样品与标准样品之间未检测出差异，判定送检样品与标准样品属于同一品种。送检样品与标准样品有一对以上（包括一对）引物检测出差异，判定送检样品与标准样品不属于同一品种。送检样品或标准样品存在两种或两种以上带型，以出现次数最多的一种带型作为该样品典型带型。DB32/T2260-20126附录A（规范性附录）主要试剂配制A.1DNA提取试剂配制A.1.12%CTAB（1000ml）加入量终浓度CTAB20g2%1mol/LTris-HCl100ml100mmol/LNaCl82g1.4mmol/L0.5mol/LEDTA40ml20mmol/LPVP2g0.2%加热，搅拌溶解后，定容到1000ml，灭菌备用。A.1.20.5mol/LEDTA（1000ml）加入量终浓度EDTA186.12gNaOH约20g将pH调至8.0蒸馏水定容到1000ml，灭菌备用。A.1.31mol/L的Tris-HCl（1000ml）加入量终浓度Tris-base121.1g浓HCl将pH调至8.0蒸馏水定容到1000ml，灭菌备用。A.1.41XTE（100ml）加入量终浓度1mol/LTris-HCl(pH8.0)1mL0.5mol/LEDTA(pH8.0)0.2mL将pH调至8.0加ddH2O定容至100mL。A.2DNA纯度检测A.2.110×TBE（1000ml）加入量终浓度Tris-base108g硼酸55g0.5MEDTA40ml蒸馏水定容到1000ml，灭菌备用。A.2.26×loadingbuffer（50ml）加入量终浓度溴芬兰0.125g蔗糖20g0.5mol/LEDTA1ml蒸馏水定容到50ml，用于琼脂糖凝胶电泳。A.3丙稀酰胺凝胶电泳试剂配制A.3.120%聚丙烯酰胺DB32/T2260-20127加入量终浓度丙烯酰胺19gN-N-二甲基双丙烯酰胺1g加ddH2O定容至100mL。A.3.28%聚丙烯酰胺20％Acr-Bis8mlddH2O8ml10×TBE4mlAPS(10％)200μlTemed20μlA.3.310%过硫酸铵（APS）加入量终浓度过硫酸铵1gddH2O10mL溶解后存于-20℃备用。A.3.4非变性上样缓冲液加入量终浓度溴酚蓝0.125g二甲苯腈0.125g蔗糖20g加ddH2O定容至50mL。A.4快速银染试剂配制A.4.110mg/mLNa2S2O3加入量终浓度Na2S2O30.5g加ddH2O定容至50mL。DB32/T2260-20128附录B（资料性附录）常用的SSR引物表B.1结球甘蓝品种纯度检测常用的SSR引物引物编号左引物(5’-3’)右引物(5’-3’)1CTTCTCTTTGAGGAGGGAAGGTGGGTRATTTCATCATTTGCCCAACATT2GAAAGGAAGTACCAATGGCGTAAAATTTAATCGCACGCCG3GGTCGGCACGAGAGCTTTAAGACCTAAAATTTAATCGCACGCCG4GTTTGGTTGGTGTGTTGAATGCGTCCAAGTCCTTCGGGGATTAC5GGACAAAACCTTTTCGACCATTTCGTTTCCCAAGTCGAAG6TGGCTTAGTGGTAACTGCCCCCGATCCATCGGAAAGAAAT7GCATCACCATGACGATTCTCCAAAAATGATGGAGGATACAAAAA8TCTTTGCTTATGATTGTGTTTCAGCCATTGTTATTCTTCTGT9CTGGTTTTCTCCTTCATCAGAGCTTTTAGCTTTTCTCTCTCTC10AAAGTCGTGGGAAGTATCGTAGGTGTAAGGATGGTGGTAGT11GGATTGCCTGAGTTTATTCTTTCTGGAGTAGATGCTTTGGT12GTAGTTGTTGTCGTGGTGGTTCATTACTCATTTCCTCTTGG13ATGGCTGTAGAAACACATTGACTGA