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ICS65.020.20B31备案号：33998-2012江苏省地方标准DB32DB32/T2093-2012葡萄苗木组培繁育技术规程Technicalregulationsforgrapemicropropagation2012-05-08发布2012-08-08实施江苏省质量技术监督局发布DB32/T2093-2012前言本规程按照GB/T1.1-2009《标准化工作导则第1部分：标准的结构和编写》的规定编制。本规程由南京农业大学园艺学院提出。本规程起草单位：南京农业大学园艺学院、江苏省果树品种改良与种苗繁育工程中心。本规程主要起草人：房经贵、郭磊、韩键、上官凌飞。DB32/T2093-20121葡萄苗木组培繁育技术规程1范围本标准规定了葡萄苗木组培繁育的术语和定义、仪器设备、试剂及培养基的准备、组培苗生产流程、培养容器和接种器械的清洗、消毒灭菌操作、培养室操作、组培苗和组培穴盘苗质量要求。本标准适用于葡萄苗木组培繁育。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的应用而成为本标准的条款。在标准出版时，所示版本均为有效。所有标准都会被修订，使用本标准的各方应探讨使用下列标准最新版本的可能性。NY/T393—2000绿色食品农药使用准则NY/T469—2001葡萄苗木DB32/T1295—2008高山杜鹃组织培养技术规程3术语和定义下列术语和定义适用于本标准。3.1组培苗plantlet利用植物器官等作为外植体，采用植物组织培养技术生产的种苗。3.2外植体explant用于离体培养的初始材料称为外植体。3.3组培穴盘苗plugplant移栽在穴盘中培育的组培生根苗。3.4初代培养primaryculture又称诱导培养，指组织培养过程中，将直接从母株采取的最初的外植体在无菌条件下进行培养以期产生不定芽、愈伤组织，从而建立无菌培养物的培养阶段。3.5继代培养subculture将培养物转移到新的培养基上继续培养的过程。4仪器设备、试剂及培养基的准备DB32/T2093-201224.1仪器设备主要有高压灭菌锅、超净工作台、药品柜、冰箱、电炉、电子天平、台秤、搅拌器、pH计、摇床以及烧杯、培养皿、三角瓶、量筒、容量瓶、磨扣试剂瓶、滴管、手术刀、镊子、剪刀、接种针、酒精灯等设备。4.2试剂试剂的选择应符合附录A所要求的试剂级别。4.3基本培养基配制制作培养基前需先配制基本培养基母液，MS基本培养基母液配制时，称取MS培养基干粉41.74g，加热溶解于1000ml蒸馏水中，116℃高压灭菌30分钟备用。4.4植物生长物质的母液配制植物生长物质的母液配制浓度0.1mg/mL～1.0mg/mL，植物生长物质的母液配制方法参见附录B。4.5培养基制作初代培养基的组成主要为1/2MS+0.03～1.0mg/LNAA+1.0mg/L6-BA。可根据不同品种、培养目的及途径，添加不同种类激素及有机添加物；增殖培养基及生根培养基同样选用MS培养基，其主要组成为1/2MS+0.1mg/LIAA。可根据不同品种、培养目的及途径，添加适量的激素及有机添加物。5葡萄组培苗生产流程5.1材料选择选择品种纯正、农艺性状优良、生长健壮、无病虫害的植株作为母株，取当年新萌发尚未木质化的新梢，剪去叶片后，剪截成带3～4个芽的茎段作为外植体。5.2外植体灭菌外植体用自来水冲洗3～4次，用70%的酒精消毒30s后用无菌水冲洗一次，根据枝条的成熟程度，在0.1%升汞溶液中浸泡5～7min，再用无菌水冲洗4～6次。5.3初代培养5.3.1操作前消毒在接种之前，工作人员的手部，包括手腕，都要用75%的酒精仔细擦拭一遍。接种器械需灭菌后晾放2min以上备用(下同)。5.3.2接种在无菌条件下，把灭菌处理后的茎段剪成单芽茎段，接入初代培养基中进行培养。外植体在瓶内要排放均匀、整齐，一般外植体初代培养20d～40d后可诱导出幼芽。5.3.3封口及时盖上瓶盖，其松紧度以用手转不动为准。5.3.4记录接种人员将品种代号、培养基类型、个人编号以及接种日期认真标示到瓶上，字迹工整。5.3.5培养条件培养温度(25±2)℃，光照强度1500lx～2000lx，光照时间每天12h～16h(下同)。DB32/T2093-201235.4增殖培养初代培养诱导形成的幼芽长至3～4片叶时，转接到增殖培养基中进行培养。特别注意的是在增殖培养过程中，随着增殖次数的增加，激素浓度也必须随之下降，否则很容易使培养物发生畸形，最后导致种苗发生变异。一般培养周期为30d左右。每隔30d继代一次。5.5生根培养从继代培养的幼苗中选取生长健壮、叶色正常、叶片舒展的无根苗，切成带有腋芽和叶片的茎段接入生根培养基上，培养基成分与增值培养培养基相同。培养20d～30d后幼苗基部长出数根新根。5.6炼苗将试管苗转移至温室，自然光下炼苗3～7d，如果光照过于强烈，需用遮阳网遮光，以免晒伤苗，湿度保持在100%左右，温度控制在25℃左右，不要超过30℃；1周后，湿度控制在80%～90%，增加光照，不要晒伤叶片；再1周后，湿度控制在60%～70%，当幼苗伸出瓶口、叶片发亮、幼茎呈淡红色时即可出瓶移栽。5.7出瓶移栽5.7.1出瓶用手指或镊子轻轻取出组培苗，放入清水内（注意水温勿相差大、冬季水温应调整为20℃～25℃）。洗去琼脂、分级待移栽。5.7.2配制混合基质配制混合基质泥碳土、珍珠岩、蛭石按一定比例混配好，装入穴盘中并压紧，定植前用0.5g/L的多菌灵溶液浸透。5.7.3定植用竹签等工具在每穴上打能容纳根系的孔，将组培苗的根系放入孔内，覆土压实。5.7.4摆放分品种、日期，归类整齐摆放。5.8穴盘苗管理5.8.1温度根据植物生长习性确定移栽时的控制温度，适宜温度为20℃～25℃。5.8.2相对湿度移栽2周～3周内用薄膜小拱棚保湿，相对湿度控制在90%左右；3周后逐渐打开薄膜小拱棚以降低湿度，8周～10周后完全打开薄膜小拱棚，大棚相对湿度保持在60%以上。5.8.3光照移栽4周内，薄膜拱棚内的光照强度控制在5000lx～10000lx，4周后逐渐增大光照强度。5.8.4浇水4周后可用喷淋浇水。5.8.5施肥移栽第4周～8周，每周喷施液肥一次，移栽8周后，视葡萄植株生长情况，浓度逐渐增加。DB32/T2093-201245.8.6喷药移栽4周后，每周喷施百菌清或多菌灵等杀菌剂一次，浓度为1500倍～1000倍；移栽第8周，视情况追施其它药剂。农药使用应符合NY/T393-2000中关于农药部分的要求。6培养容器和接种器械的清洗培养容器和接种器械的清洗标准应符合DB32/T1295—2008中的要求。7消毒灭菌操作消毒灭菌参照DB32/T1295—2008执行。8培养室操作8.1培养室培养条件调控培养室的温度一般控制在25℃±2℃，相对湿度70%～80%，光照强度1500lx～3000lx，以每天12h～16h为宜，每天早上、中午、下午各检查一次并做好记录。8.2污染检查8.2.1接种材料污染采取培养室管理员和接种员双重鉴别制，各自做好记录。8.2.2所有污染材料不应在培养室、接种室及中央走廊内开启瓶盖。8.2.3对细菌污染的生根瓶苗可转移到练苗室移栽。8.2.4对处理情况进行数据记录和简要分析原因，并反馈给操作人员。9组培苗和组培穴盘苗质量要求9.1组培苗的质量要求9.1.1整体感：苗有活力，粗壮、挺直，叶片大小协调、色泽正常，无玻璃化。9.1.2根系状况：有新鲜根系（一般3条以上），长势好、色白健壮，根长适中，基本无愈伤组织。9.1.3苗高：苗高适中，一般3cm～5cm。9.1.4叶片数：具有适宜和正常的叶片数，一般不少于3片。9.1.5整齐度：同一批次90%以上的苗高达到要求的高度。9.1.6培养基污染状况：无污染。9.2组培穴盘苗的质量要求穴盘苗的质量要求参照NY/T469—2001中的规定执行。DB32/T2093-20125附录A（资料性附录）植物组培常用化学试剂、药品一览表表A.1植物组培常用化学试剂、药品一览表品名分子式或英文名级别包装g(mL)/瓶培养基物质MS培养基干粉MSmediumBR500g植物生长物质6-苄氨基嘌呤（6-BA）6-BenzylaminopurineBR10g6-糠氨基嘌呤（激动素）6-Furfurylaminopurine(Kinetin)BR10g玉米素(ZT)ZeatinBR99%50mg萘乙酸(NAA)1-NaphthylaceticacidBR50g吲哚乙酸(IAA)3-IndoleaceticacidBR10吲哚丁酸(IBAIndole-3-butyricacidBR202,4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)2,4-dichlorophenoxyaceticacidBR50腺嘌呤(Ad)AdenineBR10赤霉素(GA3)GibberellicacidBR99%10升汞HgCl2AR250DB32/T2093-20126附录B（资料性附录）常用植物生长物质的母液配制表B.1常用植物生长物质的母液配制类别种类配制方法常用浓度mg/L细胞分裂素6-BA先用少量0.1mol/L的盐酸（HCl）溶解，然后加蒸馏水定容。0.1～2.0KT0.05～2.0ZT0.05～2.02ip0.05～2.0生长素IAA先用少量0.1mol/L的KOH溶解，然后加蒸馏水定容。0.1～1.0IBA0.05～1.0NAA0.01～0.52,4-D0.01～2.0赤霉素GA3先用少量酒精溶解，然后加水定容。0.01～0.5