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ICS65.020.20B31备案号：33994-2012江苏省地方标准DB32DB32/T2089-2012梨品种DNA指纹图谱鉴别规范RulesofidentificationforDNAfingerprintinginpearcultivars2012-05-08发布2012-08-08实施江苏省质量技术监督局发布DB32/T2089-2012前言为规范梨品种命名和保护新品种产权，促进梨苗木市场有序发展，特制定本标准。本标准编写按GB/T1.1-2009《标准化工作导则第1部分标准的结构与编写规则》的规定编写。本标准由南京农业大学提出。本标准由南京农业大学负责起草和制定。本标准主要起草人：吴俊、张绍铃、张明月、陶书田、齐开杰、黄小三、张虎平。DB32/T2089-20121梨品种DNA指纹图谱鉴别规范1范围本标准规定了梨品种登记、样本采集和处理、DNA提取与检测、分子标记扩增与检测、谱带数据分析、DNA指纹图谱建立及品种鉴别。本标准适用于梨品种资源的鉴定。2术语和定义下列定义适用于本标准。2.1DNA指纹图谱DNAFingerprint指通过DNA检测技术，获得由多个位点上的等位基因组成的长度不等的特征图纹，这种图纹极少有两个完全相同，故称为DNA指纹，意思是它同人的指纹一样是每个人所特有的。2.2SSR标记SimpleSequencesRepeatmarker指以少数几个核苷酸(1～5)为单位多次串联重复的DNA序列,由于基本单元重复次数的不同而形成SSR座位的多态性。2.3SRAP标记Sequence-relatedamplifiedpolymorphismmarker指相关序列扩增多态性，该标记对DNA的内含子、启动子区域进行特异扩增，因个体不同以及物种的内含子、启动子与间隔长度不等而产生多态性。3品种登记记录待鉴定品种资源的来源，并对该品种系谱关系的背景进行了解和登记。4仪器设备PCR仪、核酸定量分析仪（Nanodrop）、水平电泳仪、凝胶成像仪、聚丙烯酰胺凝胶电泳仪。5材料采集与处理5.1叶片采集选取生长健康良好的梨树幼嫩叶片，要求发育良好，而尚未完全展开，一般在枝的生长点附近。注意要选取完整、无病虫害或者损伤的叶片。5.2样品处理DB32/T2089-20122将采集的样品放在冰盒中，保持新鲜状态，并及时带回实验室。将所采集的样品叶片经过水清洗后，擦干，可直接用于DNA提取。如不立即使用，也可将叶片经液氮速冻后，-70℃冰箱保存备用。6DNA提取与检测6.1取样微量提取，可称取0.2～0.5g幼嫩叶片；也可按实际检测需求量，增加叶片量，但提取液也按相应比例增加。6.2DNA提取方法采用CTAB法提取梨叶片的基因组DNA，试验步骤如下：6.2.1样品研磨取适量叶片加入快速液氮研磨至粉末状，在样品解冻前，迅速转移至2ml离心管中，并加DNA提取液3ml，上下颠倒混匀后，放入65℃恒温水浴中提取，水浴时间30-50min，期间每隔8-10分钟上下轻轻颠倒混匀样品。6.2.2样品的抽提水浴后取出样品，在20℃下，12000rpm离心15min，并将上清液转移到新离心管中；等体积加入氯仿/异戊醇(24：1)抽提，颠倒混匀后摇床平和摇动15分钟，再次12000rpm离心10min；将离心管取出后，小心吸取上清液移至新离心管中，再加入氯仿/异戊醇(24：1)抽提；如此反复2～3次(可室温下操作)。6.2.3DNA的沉淀将最终抽提的液相移至新的离心管中，并加入1/10体积NaAc(3M，pH5.2)，混匀后，加入2倍体积的无水乙醇(-20℃)，缓慢颠倒混匀，并于-20℃冰箱中放置30min沉淀DNA；之后将样品取出，于4℃12000rpm离心10min。小心倒去上清液，DNA沉淀则用1ml70％乙醇溶液清洗，12000rpm离心5min，倒去乙醇溶液，如此反复2次后凉风吹干DNA。6.2.4RNA消化待管内液体挥发干并无乙醇味时，用500μlTE缓冲液(pH8.0)溶解DNA，加入2μlRNaseA(10mg/ml)降解RNA，37℃水浴保温60min；再用等体积的氯仿/异戊醇(24：1)抽提，4℃12000rpm离心10min，小心吸取上清液到新的1.5mlEppendorf管中，进行DNA的沉淀，步骤同第一次DNA的沉淀。将吹干的样品DNA，加入5-100μl灭菌纯水溶解DNA，-20℃保存备用。6.3DNA检测取3μlDNA样品在1.0％Agarose凝胶上电泳，溴化乙锭染色，紫外检测质量，基因组DNA主带清洗，大小在2000bp以上，无RNA和蛋白杂质干扰。电泳结果在凝胶成像系统下拍照记录。同时可利用核酸定量分析仪辅助检测，A260/A280值在1.8～2.0，则为纯净的DNA。利用Nanodrop微量检测样品的浓度，根据浓度的实际度数，按20ng.μL-1稀释至使用浓度。7DNA标记的扩增和检测7.1方法选择在构建梨指纹图谱过程中，根据不同的种质资源选择合适的分子标记方法，目前在果树上广泛应用、且可靠性强的分子标记主要是SSR和SRAP。SSR标记根据保守区域进行扩增，共显性好，对于DNA纯度要求低；SRAP标记多态性高，操作简单，成本相对较低。使用时可以根据实际情况，选择其中的一种分子标记类型。DB32/T2089-201237.2SSR检测体系SSR标记检测体系：取模板DNA50ng，dNTPs0.2mmol·L-1，Mg2+2.5mmol·L-1，上下游引物各0.3μmol·L-1，Taq酶1.0U，反应总体积20μL。反应程序为：94℃预变性3min，循环在94℃40s，55℃50s，72℃1min条件下运行39次，随后72℃延伸10min，最后10℃10min。7.3SRAP检测体系SRAP标记检测体系：取模板DNA30ng，dNTPs0.2mmol·L-1，Mg2+2.0mmol·L-1，上下游引物各0.2μmol·L-1，Taq酶1.0U，反应总体积20μL。反应程序为94℃预变性5min，反应前5个循环在94℃1min，35℃1min，72℃1min条件下运行；随后的30个循环退火温度提高到50℃，最后72℃延伸10min。7.4产物的检测扩增产物利用2%琼脂糖或6%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，电泳谱带在凝胶成像系统下观察统计。8指纹图谱的分析选择20对扩增稳定的标准引物，利用标准分析体系，对所有品种的遗传多态性位点进行分析和鉴定，并获得扩增谱带的记录信息。在不同的位点上将有条带记录为‘1’，无条带记录为‘0’，并建立所有数据的相似矩阵。应用数据统计对获得的指纹进行相似性及特异性分析，形成不同品种的指纹图谱。采用NTSYS-pc程序，最后以非加权数据分析法(UPGMA)来生成系统树。9品种鉴别基于所建立的一定量的品种资源DNA指纹数据库，根据相似系数的高低判断所鉴定的品种是否为相同或不同的品种。基于与已有品种遗传信息的相似性分析，为品种资源的合理保存提供科学依据。