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DB21辽宁省地方标准DB21/T1928—2011西伯利亚花楸组培快繁技术规程2011-12-28发布2012-01-28实施辽宁省质量技术监督局发布ICS65.020.01B60DB21/TXXXX—2011I目次前言....................................................................................III1范围.....................................................................................12规范性引用文件...........................................................................13术语和定义...............................................................................14培养基制作...............................................................................35外植体处理...............................................................................46接种.....................................................................................57初代培养.................................................................................58增殖培养.................................................................................69生根培养.................................................................................710炼苗....................................................................................711驯化....................................................................................812移栽....................................................................................913定植....................................................................................9附录A（资料性附录）MS培养基母液配制表..................................................10附录B（资料性附录）常用植物生长调节剂的配制............................................11参考文献..................................................................................12DB21/TXXXX—2011III前言本标准依据GB/T1.1规则起草。本标准的附录A和附录B为资料性附录。本标准由辽宁省林业厅提出并归口。本标准起草单位：辽宁省林业科学研究院。本标准主要起草人：叶景丰、马冬菁、陈罡、潘文利、范俊岗、周志权、高宇、黄国学、高军、魏忠平、祁爽。DB21/TXXXX—XXXX1西伯利亚花楸组培快繁技术规程1范围本规程规定了西伯利亚花楸（SorbussibiricaHedl）组织培养快速繁殖的方法，具体包括培养基制作、外植体处理、接种方法、初代培养、增殖培养、生根培养、炼苗、驯化、移栽和定植。本标准适用于西伯利亚花楸组培快繁育苗。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。3术语和定义以下术语和定义适用于本标准。3.1植物组织培养指利用植物体的器官、组织、细胞或原生质体为外植体，依据细胞全能性理论，将外植体接种于培养基上，在适当的培养条件下，使之发育成完整植株的技术。3.2母液为准确和方便配制培养基，将培养基的成分按一定比例和浓度混和在一起的溶液。3.3培养基将无机盐类、有机物质、植物生长调节剂等化学试剂按一定比例混合，溶解于凝固剂中，装入培养容器经灭菌而制成的培养物质。3.4外植体用于组织培养的器官、组织、细胞或原生质体。3.5消毒DB21/TXXXX—XXXX2去除或杀灭物体上微生物的方法，但细菌芽胞仍有可能存活。3.6灭菌去除或杀灭物体上所有微生物的方法，即完全的消毒。3.7接种在无菌条件下，用接种工具，将培养物放置于培养容器，尽量实现培养物无杂菌污染的过程。3.8污染培养基和培养材料生长过程中伴有真菌或细菌等微生物生长的现象。3.9试管芽在容器中生长的无污染芽。3.10增殖培养由最初的外植体上获得的培养物，转入增殖培养基上培养，对所获得的培养物进行连续多代的培养，又称继代培养。3.11增殖周期2次增殖培养的时间间隔，即增殖周期。3.12增殖芽通过增殖培养所获得的试管芽。3.13增殖系数一个培养周期内试管芽增殖倍数，即单个试管芽培养一个周期后增殖的增殖芽数。3.14生根培养把增殖芽转接到生根培养基中，诱导增殖芽生根的过程。DB21/TXXXX—XXXX33.15试管苗培养在容器中无污染的，根、茎、叶俱全的完整植株。3.16玻璃化在组织培养过程中，试管芽或苗由于生理失调而出现的嫩茎、叶片半透明水渍状的现象称玻璃化。3.17炼苗将试管苗连同培养容器移至日光温室或人工气候箱中，增强试管苗适应自然条件生长的过程。3.18驯化炼苗后的试管苗，移栽到日光温室或人工气候箱的基质中，试管苗成活并逐渐适应自然条件生长的过程。3.19组培苗经过驯化后的试管苗，即为组培苗。3.20移栽将组培苗种植在容器中适应自然条件下生长的过程。3.21定植将移栽后的组培苗种植在圃地的过程。4培养基制作4.1容器的处理4.1.1初次使用的容器，清洗干净后，用高压灭菌锅0.1MPa～0.11MPa（120℃～122℃）灭菌20min～25min，干后备用。4.1.2已用过的玻璃容器，先将残渣除去，冲洗干净，干后备用。4.2母液配制与保存4.2.1制作培养基前需先配母液，MS培养基母液配制比例参见附录A表A.1。DB21/TXXXX—XXXX44.2.2大量元素配制应分别称取，分别溶解，然后按照附表中顺序混合在一起。其它溶液逐个溶解，混在一起即可。4.2.3各种母液配制好后，要贴好标签，注明母液的名称，配制时间，配制1L培养基需要的吸取量，放入冰箱冷藏室中储存。4.31L1mol·L-1氢氧化钠（NaOH）和盐酸（HCL）的配制4.3.1称取NaOH40g，用少量溶解，定容至1L。4.3.2量取38%（m/m），密度为1.19的HCl80.7ml加蒸馏水，定容至1L。4.4100ml500mg·L-1植物生长调节剂的配制4.4.16-苄氨基嘌呤（6-BA）的配制用万分之一电子天平称取50mg细胞分裂素6-苄氨基嘌呤（6-BA），用3~5滴1mol·L-1盐酸溶解，加蒸馏水定溶至100ml，放入冰箱冷藏室储存。4.4.2生长素萘乙酸（NAA）和吲哚丁酸（IBA）的配制用万分之一电子天平称取生长素萘乙酸（NAA）和吲哚丁酸（IBA）各50mg，分别用3~5滴1mol·L-1氢氧化钠溶解，加蒸馏水定溶至100ml，放入冰箱冷藏室储存。4.51LMS培养基配制4.5.1按附录A表A.1中培养基MS配方和称取量，依次加入各母液混合。4.5.2量取琼脂粉5g加热至完全溶解后，加入母液中。4.5.3量取蔗糖30g，加热溶解后，加入母液中。4.5.4加蒸馏水定溶至1L。应采用加热后的蒸馏水，防止琼脂凝固。4.5.5逐次加入1mol·L-1氢氧化钠或盐酸充分搅拌后，调节PH值至5.8～5.9。4.6分装4.6.1在10min之内将培养基分装到培养器皿中。4.6.250ml三角瓶，分装培养基20ml/瓶；规格为5.3cm×6.0cm×9.2cm(口径×胸径×高)250ml的组织培养瓶，分装培养基40ml/瓶。4.6.3封口膜采用聚丙烯塑料膜，厚度0.06mm(6丝)，用线绳扎紧。4.7灭菌保持高压灭菌锅气压在0.1MPa~0.11MPa（120℃~122℃），20min~25min4.8保存灭过菌的培养基放在接种室保存，灭菌后凝固的培养基应在2周内用完。5外植体处理DB21/TXXXX—XXXX55.1选树选择生长健壮，无病虫害的西伯利亚花楸树，并对每个优树的外植体加标签。5.2采集在春季生长旺盛的季节（5月～6月），选择连续3天以上的晴天，剪取带有顶芽或幼嫩茎段的枝条，标明采集时间、采集地点。5.3储存和运输贮存于车载冰箱（0℃～4℃），长途运输，应采取空运的办法。6接种6.1准备工作6.1.170%酒精的配制量取70ml的无水乙醇加30ml的蒸馏水混合。6.1.2接种器械和器皿用报纸包扎好，高压灭菌锅灭菌后备用，灭菌方法同培养基灭菌。6.1.3器皿采用装有定性滤纸的培养皿，每接一批苗后，换一张定性滤纸。6.1.4开启超净工作台、接种室、缓冲间紫外灯20min～30min。6.1.5关闭紫外灯，开启超净工作台风机通风20min以上。6.1.6接种人员在更衣室更换拖鞋，穿接种服，戴上口罩后进入接种室。洗干净手后，用70%酒精喷手消毒。6.2接种6.2.1每批转接切取的芽数应不多于15个，每转接完一批苗，器械在酒精灯外焰上灼烧10s以上，6.2.2接种时应准备两套器械，交换使用。外植体或试管芽均匀接种于培养容器中，接种深度以搬运过程中不倒且切口不接触培养容器底部为准。6.2.3接种完成后在培养容器上标明接种日期。6.2.4每次接种完毕后，用70%酒精擦拭超净工作台台面。7初代培养7.1准备工作7.1.11L0.1%升汞配制与保存称取1gHgCl2，加少量温蒸馏水溶解，用蒸馏水定溶至1L，分别装入2个棕色酒精瓶中，盖好盖，同时盖外用封口膜扎紧，贴上配制浓度、日期和有毒标签，保存于接种间。7.1.2无菌水的准备DB21/TXXXX—XXXX6量取500ml蒸馏水，装入1L三角瓶，封口膜扎紧后，放入高压锅内灭菌，灭菌方法同培养基灭菌。7.2培养7.2.1初代培养基MS+6-BA0.2mg·L-1～0.5mg·L-1+NAA0.1mg·L-1～0.3mg·L-1+琼脂粉5g·L-1+蔗糖30g·L-1。7.2.2外植体处理方法剪取长1.5cm～2.0cm顶芽或带有2个腋芽幼嫩茎段，腋芽位于茎段中上部，留顶部2～3片复叶，清水冲洗2h～3h，70%酒精浸润30s，无菌水冲洗2次～3次，0.1%HgCl2消毒6min～8min，无菌水冲洗3次～4次，剪除顶芽基部、茎段两端部分。7.2.3培养容器初代培养应采用50ml三角瓶，每瓶接种1株外植体。7.2.4培养条件温度23±2℃，光照强度2000lux～3000lux，湿度30%～40%，光照周期14h·d-1。7.2.5污染率要求初代培养污染率≤50%。7.2.6诱导率要求初代培养诱导率≥50%。7.2.7诱导芽质量要求叶片绿色，芽长≥1.0cm，芽茎粗≥0.6mm，节间2个～3个，单株复叶≥2片。8增殖培