DB41T 708-2011 规模牛场口蹄疫监测技术规范

DB41河南省地方标准DB41/T708—2011规模牛场口蹄疫监测技术规范2011-12-20发布2011-12-20实施河南省质量技术监督局发布DB41/T708—2011I前言本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准由河南省畜牧局提出并归口。本标准由河南省动物疫病预防控制中心负责起草，中国动物疫病预防控制中心参加起草。本标准主要起草人：张志凌、王功民、吴志明、张健、闫若潜、方先珍、谢彩华。DB41/T708—20111规模牛场口蹄疫监测技术规范1范围本标准规定了规模牛场口蹄疫监测样品的采集和保存、监测方法和方式、监测结果的处理。本标准适用于规模牛场口蹄疫监测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T18935－2003口蹄疫诊断技术中华人民共和国农业部《口蹄疫防治技术规范》中华人民共和国农业部公告第503号《高致病性动物病原微生物菌(毒)种或者样本运输包装规范》3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1酶联免疫吸附试验（ELISA）一种酶联免疫技术。用于检测包被于固相板孔中的待测抗原(或抗体)。即用酶标记抗体，并将已知的抗原或抗体吸附在固相载体表面，使抗原抗体反应在固相载体表面进行，用洗涤法将液相中的游离成分洗除，最后通过酶作用于底物后显色来判断结果。4样品的采集和保存要求4.1样品的采集和保存4.1.1组织样品4.1.1.1样品的选择用于病毒分离、鉴定的样品应选择牛未破裂的舌面或蹄部、鼻镜、乳头等部位的水疱皮和水疱液。对临床健康但怀疑带毒的牛可在扑杀后采集淋巴结、脊髓、肌肉等组织样品作为检测材料。4.1.1.2样品的采集和保存4.1.1.2.1水疱样品采集部位可用清水清洗，不应使用酒精、碘酒等消毒剂消毒、擦拭。DB41/T708—201124.1.1.2.2未破裂水疱中的水疱液用灭菌注射器采集不少于1mL，装入灭菌小瓶中，加抗菌素（青霉素终浓度为10000IU·mL-1,链霉素终浓度为10mg·mL-1），加盖密封并用胶带封口，及时冷冻保存。4.1.1.2.3剪取新鲜水疱皮3g～5g放入灭菌小瓶中，加2倍体积的50％甘油/磷酸盐缓冲液(pH7.4),加盖密封并用胶带封口，冷冻保存。4.1.1.2.4在无法采集水疱液和水疱皮时，应采集淋巴结、脊髓、肌肉等组织样品3g～5g装入灭菌的小瓶内,加盖密封并用胶带封口，冷冻保存。4.1.1.2.5每份样品的包装瓶上均要贴上防水标签，并写明采集地点、样品编号、动物种类、时间等。4.1.2牛食道-咽部分泌物(O-P液)样品4.1.2.1样品的采集4.1.2.1.1被检动物应在采样前禁食(可饮水)12h，以免反刍胃内容物严重污染O-P液。4.1.2.1.2采样探杯在使用前经0.2％柠檬酸或2％氢氧化钠溶液浸泡5min，再用蒸馏水反复冲洗3次以上。每采完一头牛,探杯应重复进行消毒和清洗。4.1.2.1.3采样时动物站立保定，将探杯随动物吞咽动作送入其食道上部10cm～15cm处，轻轻来回移动2～3次，然后将探杯拉出。如采集的O-P液被反刍胃内容物严重污染，应用生理盐水或自来水冲洗口腔后重新采样。4.1.2.2样品的保存将采集到的8mL～10mLO-P液倒入大于25mL的灭菌玻璃容器中,容器中应事先加有8mL～10mL细胞培养液或磷酸盐缓冲液（0.04mol·L-1、pH7.4），加盖密封后充分摇匀，贴上防水标签，并写明采集地点、样品编号、动物种类、时间等，及时放入冷藏箱内，12h内转往-15℃以下冰箱冻存。4.1.3血清采集牛群发生疑似疫情而错过组织样品采集时机时，应无菌操作采集动物血液，每头不少于10mL。自然凝固后无菌分离血清装入灭菌小瓶中，加适量抗菌素（青霉素终浓度为10000IU·mL-1，链霉素终浓度为10mg·mL-1），加盖密封后2℃～8℃冷藏保存。每份样品的包装瓶上应贴上防水标签，并写明采集地点、样品编号、动物种类、时间等。通过抗体检测，做出追溯性诊断。4.2样品登记采集样品后应及时填写样品采集登记表，一式3份（参见附录A）。4.3样品的运送4.3.1将采集好的样品装入金属套筒中，套筒应填充防震材料，加盖密封，与采样记录一同装入专用运输容器中。专用运输容器应隔热坚固，内装适当冷冻剂和防震材料。4.3.2外包装上应加贴生物危险警示标识及警告语，并符合《高致病性动物病原微生物菌(毒)种或者样本运输包装规范》要求。样品应于24h内运送到检测单位。4.3.3送检材料应附有符合4.2样品采集登记表。DB41/T708—201135监测方法与方式5.1血清学监测O型口蹄疫抗体检测用正向间接血凝试验（IHA）或液相阻断酶联免疫吸附试验（ELISA），O型合成肽疫苗免疫后抗体检测用相应的口蹄疫病毒VP1结构蛋白抗体间接ELISA；亚洲Ⅰ型和A型口蹄疫抗体检测用液相阻断ELISA。具体试验方法按照《口蹄疫防治技术规范》操作。5.2病原学监测采用RT-PCR方法直接检测病原。具体按照GB/T18935－2003操作。5.3疫情监视与报告县级以上动物防疫监督机构应每月按5.1、5.2的方法开展一次口蹄疫疫情普查。牛场怀疑发生口蹄疫时，应立即报告当地动物防疫监督机构，并采集样品送省级动物防疫监督机构检测，必要时送国家口蹄疫参考实验室确诊。5.4免疫效果监测结果判定5.4.1O型正向间接血凝抑制试验的抗体效价≥25为合格。5.4.2亚洲I型、A型液相阻断ELISA的抗体效价≥26为合格。5.4.3存栏牛群免疫抗体合格率≥70%判定合格。5.5监测要求5.5.1监测对象包括不同年龄/品种的牛。5.5.2样品采集及检测5.5.2.1免疫效果监测采集牛的血清，检测方法参照5.1。5.5.2.2病原学监测采集牛的血清、O-P液和组织样品等，检测方法参照5.2。5.5.3抽样方法及数量5.5.3.1抽样方法：依照牛存栏数量采取层次分类随机选样法抽样。5.5.3.2抽样数量：被检牛群的10%。6监测结果处理6.1存栏牛群免疫抗体合格率≤70%，牛群应立即加强免疫一次。6.2病原学监测有疑似阳性样品存在，应立即报告当地动物疫病预防控制机构，并送样至国家口蹄疫参考实验室确诊。DB41/T708—201146.3免疫效果监测和病原学监测结果每月应向当地动物疫病预防控制机构报告一次，规模牛场对监测结果应存档或备案。DB41/T708—20115附录A（资料性附录）样品采集登记A.1样品采集登记表样品采集登记表参见表A.1。表A.1样品采集登记表采样日期：编号：场/户/养殖小区名称采样地点省（市）市(地、州)县(市、区)镇(乡)场/村联系人联系电话被采样牛类别日龄存栏量样品名称样品数量样品编号被采样牛临床健康状况DB41/T708—20116表A.1（续）被采样牛免疫情况免疫病种疫苗类型疫苗厂家疫苗批号免疫次数免疫剂量末次免疫时间/末次免疫至采样的间隔天数被采样单位盖章（签名）年月日采样单位盖章（采样人签名）年月日备注A.2说明A.2.1样品名称指全血、血清、抗凝血、棉拭子、心脏、肺脏、气管、脑等脏器组织。A.2.2疫苗类型中应注明所用疫苗的具体型（O型、A型、亚洲Ⅰ型）、疫苗种类（单联疫苗或多联疫苗，灭活疫苗或合成肽疫苗）等信息。A.2.3此单一式三份，第一联由采样单位保存、第二联随样品、第三联由被采样单位保存。