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ICS67.080.20B39DB35福建省地方标准DB35/T1203—2011银耳栽培种质量检验规程RegulationsofqualityinspectionforTremellaspawn2011-10-28发布2012-02-15实施福建省质量技术监督局发布DB35/T1203—2011I前言本标准依据GB/T1.1-2009的起草规则起草。本标准由福建省质量技术监督局提出并归口。本标准起草单位：福建农林大学菌物研究中心、全国银耳标准化工作组。本标准主要起草人：温志强、刘新锐、董秀云、郑昭、谢宝贵、吴小平。DB35/T1203—20111银耳栽培种质量检验规程1范围本标准规定了银耳栽培种质量检验的术语和定义、真实性检验、纯度检验和活力检验和检验判定规则。本标准适用于银耳栽培种质量的检验。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。NY/T1097-2006食用菌菌种真实性鉴定酯酶同工酶电泳法NY/T1284-2007食用菌菌种中杂菌及害虫的检验DB35/T137.5古田银耳菌种制作规程DB35/T1021-2010食用菌品种鉴别技术规范-DNA指纹法DB35/T1022-2010食用菌菌种纯度检测方法DB35/T1026-2010野生食用菌菌种分离与鉴定技术规范3术语和定义NY/T1284-2007、NY/T1097-2006、DB35/T1026-2010中界定的以及下列术语和定义适用于本文件。为了便于使用，以下重复列出。3.1银耳栽培种经人工培养可供栽培使用的银耳菌丝与香灰菌的混合培养物。3.2银耳栽培种的真实性指同时含有银耳Tremellafuciformis菌丝和香灰菌Hypoxylonstygium菌丝的菌种。3.3银耳栽培种纯度银耳栽培种的纯度是指银耳栽培种受其它生物污染的程度。3.4银耳栽培种的活力DB35/T1203—20112指银耳栽培种的健壮程度。3.5害虫各种为害食用菌的昆虫和螨类。[NY/T1284-2007，3.2]3.6核糖体转录间隔区在真菌中，18S、5.8S、28S核糖体RNA的基因串联在一起，同时被转录，这三个基因之间被一段DNA序列隔开（ITS），18S和5.8S、5.8S和28S的基因之间的间隔区分别称为ITS1和ITS2，ITS序列具有较高的保守性，种内不同菌株之间的ITS序列同源性很高，但种间的差异较大，它可用于种的鉴别。[DB35/T1026-2010，3.9]3.7霉菌具管状菌丝营养体并产生大量孢子的小型真菌。[NY/T1097-2006，2.1.10]3.8放线菌分枝丝状的单细胞原核生物。[NY/T1097-2006，2.1.11]3.9酵母菌营出芽系列的单细胞真菌。[NY/T1097-2006，2.1.12]3.10细菌以裂殖方式繁殖的单细胞原核生物。[NY/T1097-2006，2.1.13]3.11菌龄接种后菌丝在培养基物中生长发育的时间。[NY/T1097-2006，2.3.22]DB35/T1203—201134银耳栽培种的真实性检验4.1取样用接种钩均匀取银耳栽培种表面白毛团及基部培养物，称取2g，放到预冷的研钵中。4.2DNA的提取银耳栽培种DNA的提取方法按照DB35/T1021-2010中7.2DNA的提取方法执行。4.3ITS扩增ITS扩增按照DB35/T1026-2010中7.2.2.2ITS-PCR的方法执行。但所使用的ITS引物为ITS5和ITS4。ITS5：5’-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3’；ITS4：5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’。4.4ITS扩增产物的检测ITS扩增产物的检测按照DB35/T1026-2010中7.2.2.3ITS-PCR的方法执行。4.5ITS片段的回收把扩增的ITS片段进行单一片段分别回收。4.6ITS片段的克隆与测序ITS片段的克隆与测序按照DB35/T1026-2010中7.2.2.4ITS片段的克隆与测序的方法执行。4.7ITS序列相似性计算方法待检样ITS序列与标准菌株ITS序列匹配的碱基数比上标准菌株ITS序列碱基数(100%)5银耳栽培种纯度检验银耳栽培种中的细菌污染、霉菌污染、酵母菌污染、螨虫为害检测检验按照NY/T1284-2007、DB35/T1022-2010方法执行。6银耳栽培种活力检验6.1银耳栽培种外观检验用肉眼观察银耳栽培种的颜色、分泌液等。6.2银耳栽培种粗酶液制备在银耳栽培种中间均匀取白毛团鲜重5g，加入25ml蒸馏水并搅匀，浸提2h后进行抽滤，抽滤后的溶液即为银耳栽培种粗酶液。设置3-5个重复。6.3银耳栽培种多酚氧化酶检测在15mm×150mm试管中分别加入0.1mol/L邻苯二酚2ml、0.05mol/LpH6.0的磷酸缓冲液2ml、银耳栽培种粗酶液0.5ml，28℃水浴保温30min，用紫外分光光度计，选择400nm波长测量反应液的OD值。DB35/T1203—201146.4银耳栽培种漆酶检验在15mm×150mm试管中分别加入0.1mol/LpH4.6的乙酸缓冲液3.4ml、3.36mmol/L的邻联甲苯胺0.5ml、银耳菌种粗酶液0.5ml，28℃水浴保温30min，用紫外分光光度计，选择600nm波长测量反应液的OD值。7判定规则7.1银耳栽培种真实性ITS扩增产物经检测、ITS片段的克隆与测序后，图谱上同时出现535bp和910bp两条片段，且满足其中535bp的片段序列和银耳Tremellafuciformis的ITS序列相似性达98%以上的为银耳种性，否则是其它菌；其中910bp的片段序列和香灰菌Hypoxylonstygium的ITS序列相似性达98%以上的为香灰菌种性，否则是其它菌。标准的银耳Tremellafuciformis和香灰菌Hypoxylonstygium的ITS序列见附录A。检测菌种同时含有银耳ITS标记和香灰菌ITS的为完整菌种，否则为不完整菌种。7.2银耳栽培种纯度按照NY/T1284-2007、DB35/T1022-2010的检测方法，检测结果未检出除银耳、香灰菌以外其他生物的菌种，判定为菌种纯；检测结果若出现细菌、霉菌、酵母菌、螨虫或其它生物的其中一种或一种以上，为污染菌种，判定为菌种不纯。7.3银耳栽培种活力7.3.1菌龄规定：培养基按DB35/T137.5执行。7.3.2感观要求：白毛团色洁白，形状圆整、丰满，分泌液清亮，无浊液；香灰菌丝生长有力，分布均匀，分泌黑色素，瓶壁上出现黑色花纹。7.3.3生化指标：此外银耳栽培种的多酚氧化酶活性的OD值在0.2以上，同时满足银耳栽培种的漆酶活性的OD值在0.05以上，则表明银耳栽培种的活力强；否则活力弱。7.4银耳栽培种质量评价同时满足银耳栽培种的真实性、纯度和种活力要求的银耳栽培种为合格，否则为不合格。DB35/T1203—20115AA附录A（规范性附录）银耳Tremellafuciformis和香灰菌Hypoxylonstygium的ITS序列A.1银耳Tremellafuciformis的ITS序列TCCTCCGCTTATTGATATGCTTAAGTTCAGCGGGTAGCCCTACCTGATTTGAGGCCAGAGTGCAAAAGTAAAGGGGGTTGTGAGCGGCCCACAGTCGACGCGTAACTTACGACGTCTGCGTGAAACCACTAACGCATTTAAGGCCAGCCAGAGAGGCAGGGCCCAAATCCAACACCGCCGGGTCAGAAACCCAGGGGGTTGAGTCTACATGACACTCAAACAGGCATGCCTTTCGGAATACCAAAAGGCGCAAGGTGCGTTCAAAGATTCGATGATTCACTGAATTCTGCAATTCACATTACTTTTCGCAATTCGCTGCGTTCTTCATCGATGCGAGAGCCAAGAGATCCGTTGTTGAAAGTTGTTTCATGTTATGATGCATTACGTTCTTGACATATGTTTGTGTGAAGGCGGCCCGGCCCGGGGGCGCGGTCCGATGTGCACAGGTGTTTGGAAGGGCCTCGTGGCCCGGTGTAATCTCAAATGATCCTTCCGCAGGTTCACCTACGGAAACCTTGTTACGACTTTTACTTCC。A.2香灰菌Hypoxylonstygium的ITS序列TCCTCCGCTTATTGATATGCTTAAGTTCAGCGGGTATTCCTACCTAATCCGAGGTCAACCACTATAAGTTATAGGGGGTTTTACGGCAAGCAGCTACAGCCTCCCTGAAAGCGAGTTAAACTACTACGCTTAGAGTGTGCTATAACCCCGCCACTAAATTTAAGGAACTACCCCTCAGTGAGGGGTAGATTCCCAACGCTAAGCTACAAGGCTTAAGGGTTGTAATGACGCTCGAATAGGCATGCCCACTAGAATACTAATGGGCGCAATGTGCGTTCAAAGATTCGATGATTCACTGAATTCTGCAATTCACATTACTTATCGCATTTCGCTGCGTTCTTCATCGATGTCAGAACCAAGAGATCCGTTGTTGAAAGTTTTAACGTATTTGGTTTTTAAAACCTTGGTTTGATCACCCCCTAAGAACCGTAGTTTATAGGTGGCTTTTGCCAATTTTATGAATTCATTCAGACCCCTCAGAGCTTTGAACAATTTTCGAGCAGATATTGTAGCTTGAAAACAAACGACTGCAGGGTAAAGAAATTATTATTTCGAGCAATAATTCCAACCAGGAAAGACGTTTTAGCGTAAAGAAAAAAAGCAAAAGCAGATTTTCGATAGTTGTTCAACGCGGGGTTGGATGCACTAGGTGCTTAAGTTTGGAGCGGTCCTACTCGGCGCCGCCGAGGCCTTGGTCAGCACCTTCACTGCACTAACCGTACCCCGAAGGATGGGTAGCACTCAGGCACCTCCCCAGCAGAACCCCCCCTTAGGGGAGCCCTGTGGGTAGGCTAAAGCGGTACGCCGGAGGAAACATAGGTAGGTTCACAAAGGGTTGGAGTTTTTGATAACTCAGTAATGATCCCTCCGCTGGTTCACCAACGGAGACCTTGTTACGACTTTTACTTCC。_________________________________