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ICS65.020.30B40备案号：江苏省地方标准DBDBDBDB32323232DB32/T1824—2011禽肉肌纤维特性的测定石蜡切片法Determinationofpoultrymusclefibercharacteristic——Paraffinsectionmethod2011-06-15发布2011-08-15实施江苏省质量技术监督局发布DB32/T1824—2011I前言本标准按GB/T1.1-2009《标准化工作导则第1部分：标准的结构与编写》的规定编写。本标准由江苏省家禽科学研究所提出。本标准起草单位：江苏省家禽科学研究所、农业部家禽品质监督检验测试中心（扬州）、扬州翔龙禽业发展有限公司。本标准主要起草人：唐修君、高玉时、王克华、葛庆联、陆俊贤、施祖灏、张小燕、蒲俊华。DB32/T1824—20111禽肉肌纤维特性的测定石蜡切片法1范围本标准规定了石蜡切片法测定禽肉肌纤维特性的术语和定义、试剂与配制、仪器和设备、样品处理、切片制作、读片与计算、数据纪录和允许差。本标准适用于石蜡切片法测定禽类肌纤维密度、直径、间距、肌束间距以及肌大束间距。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本部分。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本部分。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法3术语和定义下列术语和定义适用于本标准3.1肌纤维密度Musclefiberdensity同一肌束内，单位面积肌纤维根数。3.2肌纤维直径Musclefiberdiameter肌纤维长径与短径的几何平均数。3.3肌纤维间距Musclefibergap同一肌束内，相邻肌纤维之间的垂直距离。3.4肌束间距Musclebundlegap同一肌大束内，相邻肌束之间的垂直距离。3.5肌大束间距Distancebetweenmusclebundles相邻肌大束之间的垂直距离。4试剂与配制DB32/T1824—20112除特殊注明外，本法所用试剂均为分析纯，用水符合GB/T6682一级水的规定。4.14%甲醛溶液1体积甲醛与9体积水混匀。4.2无水乙醇4.375%酒精7.5体积无水乙醇与2.5体积水混匀；85%酒精：8.5体积无水乙醇与1.5体积水混匀；95%酒精：9.5体积无水乙醇与0.5体积水混匀。4.4二甲苯4.5石蜡65℃反复提炼，直至蜡的颜色泛黄可用。4.6苏木素4.71%盐酸酒精1体积盐酸与99体积无水乙醇混匀。4.80.5%伊红酒精称取0.5g伊红，用100mL无水乙醇溶解。4.9中性树脂5仪器和设备5.1组织切片机切片厚度5µm～1000µm。5.2烘箱精度±1℃。5.3恒温水浴锅精度±1℃。5.4包埋框5.5镊子使用之前放入60℃烘箱中预热。5.6载玻片和盖玻片用洗液浸泡24h后用自来水充分洗涤，再用95%酒精浸泡后用软绸布或纱布擦干，待用。5.7光学显微镜DB32/T1824—20113放大倍数10×4至10×40。6样品处理6.1取样与固定家禽宰杀放血后，在30min内顺着肌纤维方向取样，胸肌取样部位为胸大肌前端1/3、距龙骨2cm处，腿肌取样部位为大腿肌中部，距股骨1cm处，取样大小为长×宽×高约2cm×1cm×1cm。剔除肌肉表面筋、腱、膜及脂肪，随即置于4%甲醛溶液中固定10h，取出修成0.7cm×0.6cm×0.4cm大小的组织块，重新置于4%甲醛溶液中继续固定12h。6.2洗涤将组织样置于流动的自来水下，浸泡10h~15h。6.3脱水采用不同浓度的酒精对组织样进行梯度脱水，脱水步骤、酒精浓度和各步骤所需时间见表1。表1脱水步骤、酒精浓度和各步骤所需时间步骤酒精浓度时间一75%2h～4h二85%2h～4h三95%2h～4h四无水乙醇2h～3h五无水乙醇2h～3h6.4透明将组织放进二甲苯中浸泡10min～15min，至组织呈半透明或透明状态，用肉眼可观察到透明感时立即取出。6.5浸蜡和换蜡6.5.1浸蜡：将透明好的组织块完全置于60℃石蜡中浸泡2h。6.5.2换蜡：将蜡块取出立即另置于60℃新蜡中再浸泡2h左右。6.6包埋和修块将熔化的石蜡倒入包埋框，待蜡将近凝固之前，用镊子将组织块放至包埋框接近底部的位置，使肌纤维长轴与待切面垂直，将准备好的标签放在待凝固的蜡上面，完全自然冷却后，切去余蜡部分，根据需要适当修整蜡块，一般修成方形或梯形。7切片制作7.1切片、展片和贴片、烤片7.1.1切片：使用组织切片机切片，切片厚度宜为7µm，前15张切片一般不用。7.1.2展片和贴片：将切好的蜡片轻轻平铺于10-20℃水中展片，用载玻片从切片下面轻轻捞起，立DB32/T1824—20114即置于40℃恒温水浴锅中贴片，切片和载玻片之间不应有气泡。7.1.3烤片：将粘有切片的载玻片置于60℃烘箱内烤片24h。7.2染色切片烤片后采用二甲苯两次脱蜡、梯度酒精洗二甲苯，之后进行苏木素-伊红（HE）染色。各步骤名称、所需试剂和时间见表2表2切片染色各步骤名称、所需试剂和时间步骤名称试剂时间一脱蜡二甲苯10min二再脱蜡二甲苯10min三洗二甲苯（Ⅰ）95%乙醇1min四洗二甲苯（Ⅱ）85%乙醇1min五洗二甲苯（Ⅲ）75%乙醇1min六洗酒精自来水1min七染色苏木素10-20min八水洗自来水至切片呈淡蓝色九分化1%盐酸酒精1s十水洗自来水返蓝即可十一染色0.5%伊红酒精20s十二水洗自来水多次水洗，至切片红色变淡7.3封片如需长期保存切片，则应进行封片。切片晾干后，使用中性树脂封片，中性树脂的量以封片后能完全盖住切片为宜，封片过程中不应有气泡。8读片与计算8.1肌纤维密度随机取3张切片，每张切片取3个或3个以上视野，在10×10倍显微镜下读出每个视野肌纤维根数，求加权平均数，按公式（1）计算。X=（X1/Y1＋X2/Y2＋X3/Y3……＋Xn/Yn）×106/N………………………………（1）式中：X——肉样肌纤维密度，单位为根每平方毫米（根/mm2）；X1……n——每个视野中肌纤维根数，单位为根；Y1……n——每个视野面积，单位为平方微米（um2）；N——视野数（大于或等于9）。8.2肌纤维直径随机取3张切片，每张切片取3个视野，每个视野取10根或10根以上肌纤维，在10×40倍显微镜下，测量每根肌纤维长径和短径距离，算出几何平均值，再求加权平均数，按公式（2）计算。X=[（X1＋Y1）/2＋（X2＋Y2）/2＋（X3＋Y3）/2……＋（Xn＋Yn）/2]/N…………………（2）DB32/T1824—20115式中：X——肉样肌纤维直径，单位为微米（µm）；X1……n——肌纤维长轴距离，单位为微米（µm）；Y1……n——肌纤维短轴距离，单位为微米（µm）；N——肌纤维根数（大于或等于90）。8.3肌纤维间距随机取3张切片，每张切片取3个视野，每个视野测量10个或10个以上间距，在10×40倍显微镜下，测量每个间距距离，求加权平均数，按公式（3）计算。X=（X1＋X2＋X3……＋Xn）/N………………………………（3）式中：X——肉样肌纤维间距、肌束间距或肌大束间距，单位为微米（µm）；X1……n——每个肌纤维间距、肌束间距或肌大束间距，单位为微米（µm）；N——间距数（大于或等于90）。8.4肌束间距按8.3执行。8.5肌大束间距按8.3执行。9数据记录记录数据时应仔细填写所取肉样种类、取样部位及检测数据，计算结果保留两位有效数字。10允许差同一肉样，有效区域的测定值允许的相对偏差应≤15%。