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ICS65.020.01DB52贵州省地方标准DB52/T604—2010马铃薯原原种生产技术规程2010-06-24发布2010-07-01实施贵州省质量技术监督局发布DB52/T604-2010I前言本标准的附录A是资料性附录。本标准由贵州省农业委员会提出并归口。本标准由贵州省种子管理站、贵州省马铃薯研究所、贵州省扶贫技术指导中心、贵州省农技总站负责起草。本标准主要起草人：施文娟、黄萍、宋耀、苏跃、杨恩琼、颜谦。DB52/T604-20101马铃薯原原种生产技术规程1范围本标准规定了马铃薯脱毒苗和原原种的生产技术。本标准适用于马铃薯原原种的生产。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB18133马铃薯脱毒种薯NY/T1212—2006马铃薯脱毒种薯繁育技术规程NY/T401—2000脱毒马铃薯种薯（苗）病毒检测技术规程3术语和定义下列术语和定义适用于本标准。3.1外植体用于马铃薯茎尖培养的幼芽段。3.2培养基一种人工配制的、适合培养材料生长繁殖的混合养料。主要由一定比例的无机盐、有机物、蔗糖、植物生长调节剂组成，其中不加凝固剂呈液态的培养基质称为液体培养基，加入凝固剂呈固态的培养基质称为固体培养基。3.3消毒一种采用较温和的理化因素，仅杀死物体表面或内部一部分有害病原菌，而对被消毒物体基本上无害的措施。3.4灭菌采用强烈的理化因素使任何物体内外部的一切微生物永远丧失其生长繁殖能力的措施，如各种高温灭菌技术措施等。3.5扩繁给予合适的培养条件，在人工配制的培养基上、短期内繁殖出大量新植物体的技术。3.6脱毒DB52/T604-20102应用茎尖分生组织培养技术，脱去主要危害马铃薯的病毒及类病毒。3.7脱毒试管苗应用茎尖分生组织培养技术获得的再生试管苗，经检测确认不带马铃薯X病毒（PVX）、马铃薯Y病毒（PVY）、马铃薯S病毒（PVS）、马铃薯卷叶病毒（PLRV）、马铃薯M病毒（PVM）和马铃薯纺锤块茎类病毒（PSTVd）的试管苗。3.8原原种用脱毒试管苗或种子在防虫网室、温室条件下生产的符合质量标准的微型薯。4脱毒试管苗建立4.1薯块选择选择田间生长势强、健壮、具有该品种典型特征的植株块茎进行脱毒。4.2外植体选择选择无病虫、生长健壮的幼芽，切取带生长点的茎段2.0cm～3.0cm，用自来水冲洗干净。4.3茎尖剥离将表面冲洗干净的外植体置于超净工作台上，先用70%的酒精表面消毒10s，用2%的次氯酸钠溶液消毒10min～15min后，无菌水冲洗3次～5次，置于无菌滤纸上吸去水分。将消毒好的外植体置于超净工作台上的双目解剖镜下，用解剖针轻轻剥去外植体上的未展开小叶至露出茎尖生长点，在1个～2个叶原基（大小0.2cm～0.4mm）处用解剖刀小心地将其切下，茎尖向上、切面向下置于试管或三角瓶内的茎尖诱导培养基上（配方见本标准资料性附录A），封口、编号。4.4茎尖组织培养将马铃薯茎尖置于温度22℃±2℃、光照强度2000Lx～3000Lx、每日光照12h～16h的光照培养箱或培养室，培养，茎尖经生长分化即可形成具2片～4片展开叶的试管苗。4.5试管苗的病毒检测参照NY/T401—2000，采用双抗体夹心酶联免疫法（Dot—ELISA）对各试管苗株系的PVX、PVY、PVS、PLRV和PVM病毒进行检测，不带以上5种病毒的试管苗即为脱毒试管苗。5脱毒试管苗的扩繁5.1试管苗的扩繁在超净工作台上，将形成6片～10片叶的马铃薯脱毒试管苗进行切段，每段留1片叶，叶面朝上插在固体增殖培养基上（配方见本标准资料性附录A），于培养箱或培养室内培养。5.2脱毒试管苗扩繁的培养条件温度22℃±2℃，光照强度2000Lx～3000Lx，每日光照12h。DB52/T604-201035.3脱毒试管苗检测马铃薯脱毒试管苗扩繁过程中的检测参照GB18133中的5.1.2执行。6原原种的生产6.1网棚构建参照NY/T1212—2006中的9.3.6执行。6.2基质配方参照NY/T1212—2006中的9.2执行。6.3基质消毒在组培苗移栽前2Od，用土壤消毒剂（如100倍福尔马林水溶液，按5kg／667㎡）对基质进行细菌和真菌消毒。6.4移栽苗的筛选选择具4片～7片叶、株高5cm～8cm、根长1.5cm～2.0cm的组培苗用于网棚内移栽。6.5试管苗的棚内移栽按照要求选取马铃薯脱毒试管苗，洗去根部培养基后移栽至大棚中，移栽密度是5cm×5cm～10cm。6.6遮荫保湿移栽前苗床浇透水保持充分湿润，移栽后搭小拱棚并加遮阳网保湿遮阴。中途无需浇水，待苗形成新根后可拆除小拱棚及遮阳网。6.7肥水管理据基质类型、试管苗的生长状况对其进肥水管理6.8病虫害防治6.8.1阴天雨季，气温在10℃～25℃时，防治晚疫病的发生，可用58%甲霜灵锰锌可湿性粉剂500倍液、72%霜霉疫净可湿性粉剂1000倍液或68%银发利700倍液等药剂喷雾防治2次～5次，间隔期7d～15d。6.8.2在蚜虫普发季节，用黄板或喷施药剂以防蚜虫，可选药剂如4.5%高效氯氰菊酯乳油2000倍液、10%吡虫啉1000倍液或40%乐果乳剂1000倍液等。6.8.3在潜叶蝇普发时间(5月～7月)，可用20%斑潜净3000倍液、1.8%集琦虫螨克乳油4000倍液或1.8%阿维菌素乳油2000倍液等药剂防治潜叶蝇的发生。6.9原原种采收一般移栽60d～90d后下部叶片枯黄便可收获，收获前一周割秧。收获时尽量不要弄破种皮和薯块，种薯浅层堆放5d～10d后分级考种，装入网袋置于高温冷库（3℃～7℃）内贮藏。DB52/T604-20104AA附录A（资料性附录）培养基配制方法A1仪器和设备A1.1高压灭菌锅A1.2冰箱A1.3烘箱A1.4双目实体解剖镜A1.5天平A1.6酸度计或pH试纸A1.7加热器A1.8不锈钢锅A1.9量筒、移液管A1.10烧杯、玻璃棒和滴管A1.11试管、三角瓶、培养瓶、耐高温封口材料或瓶盖A1.12手术剪、手术刀、解剖针、镊子A1.13超净工作台A1.14塑料大棚或60目网棚A2试剂茎尖组织培养所用试剂为分析纯级别，培养基用水为蒸馏水；试管苗扩繁生产所用试剂为分析或化学纯级别，水为自来水。A2.1MS培养基母液成分及含量（mg/L）大量元素：硝酸钾KNO31900，硝酸铵NH4NO31650，硫酸镁MgSO4370，磷酸二氢钾KH2PO4170，氯化钙CaCl2·2H2O440微量元素：硫酸锰MnSO4·4H2O2230，硫酸锌ZnSO4·7H2O860，硼酸H3BO3620，碘化钾KI83，钼酸钠Na2MoO4·2H2O25，硫酸铜CuSO4·5H2O2.5，氯化钴CoCl2·6H2O2.5铁盐：乙二胺四乙酸二钠Na2-EDTA37.3，硫酸亚铁FeSO4·7H2O27.8有机物：甘氨酸2.0，盐酸硫胺素VB10.4，盐酸吡哆醇VB60.5，烟酸0.5，肌醇100A2.2酒精、盐酸HCl、氢氧化钠NaOH、6-苄氨基腺嘌呤6-BA、萘乙酸NAA、赤霉素GA3A2.3蔗糖、琼脂A3培养基类型A3.1茎尖培养基：MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.05mg/L+GA30.1mg/L+蔗糖30g/L+琼脂6～9g/LA3.2固体扩繁培养基：MS+白糖30g/L+琼脂6～9g/LA4操作步骤A4.1MS培养基母液配制配制MS培养基母液使用的水质为蒸馏水、重蒸馏水或无离子水大量元素母液配制：按100倍的用量分别称取各大量元素，并单独定溶配制成母液。每升培养基DB52/T604-20105取各种母液10ml。微量元素母液配制：按100倍的用量分别称取各微量元素，单独溶解，再混合、定溶。每升培养基取此母液10ml。铁盐配制：按100倍用量分别称取两种试剂，单独加热煮沸、再混合，混合后的溶液继续加热使之充分螯合，冷却后定溶备用。每升培养基用铁盐母液10ml。有机物配制：以100倍用量分别称量分别溶解，再混合、定溶。每升培养基取此母液10ml。A4.2植物激素配制：萘乙酸NAA配制：按0.01mg/ml浓度适量称取萘乙酸NAA，先用少许95%酒精溶解，再用蒸馏水定溶，置于4℃冰箱贮藏待用。赤霉素GA3配制：按0.1mg/ml浓度适量称取赤霉素GA3，先用少许95%酒精溶解，再用蒸馏水定溶，置于4℃冰箱贮藏待用。6-苄氨基腺嘌呤6-BA配制：按0.5mg/ml浓度适量称取6-苄氨基腺嘌呤6-BA，用少许1NHCl溶解，再用蒸馏水定溶，置于4℃冰箱贮藏待用。A4.3MS培养基配制方法A4.3.1溶化琼脂按需量称取琼脂入不锈钢锅内，加入所需配制培养基体积一半的水，加热溶化琼脂备用。A4.3.2加母液将称量好的各种母液、糖加到溶解好的琼脂液中，继续加热并搅拌，待糖溶解，加水至所需配制培养基体积，搅拌均匀。A4.3.3调pH值用酸度计或精密pH试纸（测量范围5.5-9.0）测量所配制培养基的pH值，加0.1NHCl或NaOH溶液调节培养基pH值在5.8～6.0。A4.3.4分装趁热将培养基分装于试管、三角瓶或培养瓶内（不要将培养基粘附到培养瓶口），用耐高温高压材料封口，待灭菌。A4.3.5高压灭菌用饱和蒸汽彻底排出高压灭菌锅内空气后，加热至121℃，湿热灭菌20～40min（灭菌物体积越大，所需灭菌时间延长）后断电，待灭菌锅气压降至常压后，将培养基移到洁净室，备用。_________________________________