db440300 t 32.3-2007 农业转基因生物食用安全性检验 第3部分致敏性

B04ICS65.020.01DB深圳市农业地方标准DB440300/T32.3—2007农业转基因生物食用安全性检验第3部分：致敏性检验Ediblesafetydeterminationofagriculturegeneticallymodifiedorganisms—PartⅢ:Testingforallergenicity2007-11-12发布2008-02-12实施深圳市质量技术监督局发布DB440300/T32.3—2007I目次前言.................................................................................II1范围................................................................................12规范性引用文件......................................................................13术语和定义..........................................................................14项目与程序..........................................................................15受体生物致敏性的检验................................................................16外源基因对受体生物致敏性影响的检验..................................................3附录A（规范性附录）消化酶和热加工耐受性试验.........................................9附录B（规范性附录）SDS-PAGE凝胶电泳............................................10B.1凝胶制备.........................................................................10B.2样品处理及上样...................................................................10B.3电泳.............................................................................10B.4染色和脱色.......................................................................11参考文献.............................................................................12DB440300/T32.3—2007II前言DB440300/T32-2007《农业转基因生物食用安全性检验》分成五个部分：——第1部分：样品制备；——第2部分：毒性检验；——第3部分：致敏性检验；——第4部分：抗营养作用检验；——第5部分：非期望效应检验。本部分为DB440300/T32的第3部分。附录A、B为规范性附录。本部分由深圳市农林渔业局和深圳市卫生局提出。本部分由深圳市农林渔业局和深圳市卫生局负责解释。本部分主要起草单位：深圳市农作物良种引进中心、深圳市疾病预防控制中心。本部分主要起草人：周向阳邓平建侯红利杨冬燕刘晋杨永存王学林杨小柯李永红吴水清周鹏杜忠DB440300/T32.3—20071农业转基因生物食用安全性检验第3部分：致敏性检验1范围本部分规定了农业转基因生物致敏性检验的项目、程序和方法。本部分适用于农业转基因生物致敏性的检验。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的昀新版本。凡是不注日期的引用文件，其昀新版本适用于本标准。GB/T6682分析实验室用水规格和实验方法SZJG23农业转基因生物食用安全性要求和评价DB440300/T32.1农业转基因生物食用安全性检验第1部分：样品制备DB440300/T32.2农业转基因生物食用安全性检验第2部分：毒性检验3术语和定义SZJG23确立的术语和定义适用于本部分。4项目与程序4.1检验项目4.1.1受体生物致敏性。4.1.2外源基因对受体生物致敏性的影响。4.2检验程序检验程序见图1。5受体生物致敏性的检验5.1资料性审查5.1.1申报资料审查对待检的转基因生物的受体生物食用史、食用致敏记录及安全控制措施的资料进行审查，分析受体生物的致敏性及可能存在的天然生物致敏成分名称及分布状态、受体生物食用方法和加工方式对其所含致敏成分安全控制措施的作用和效果。5.1.2信息检索应用国际通用的生物信息学数据库，检索受体生物的食用致敏记录及可能存在的天然生物致敏成分名称、分布状态、分子量、氨基酸序列、分子特性及相关基因序列。注：通用生物信息学数据库的定义同DB440300/T32.2中5.1.2的注解。5.1.3结果判定5.1.3.1受体生物在国内或国外有长期食用史，可判定受体生物为传统农业生物。DB440300/T32.3—200725.1.3.2受体生物在国内外均无食用史，或者仅在国外少数国家有食用史，或者仅在国内少数地区有食用史的生物，可判定受体生物为非传统农业生物。5.1.3.3受体生物为花生、大豆、小麦、坚果、鱼、贝类、奶牛（主要致敏源是牛奶）、家禽（主要致敏源是禽蛋）或数据库登录的含有天然生物致敏成分的其他生物，可判定受体生物有天然生物致敏成分。5.1.3.4受体生物为5.1.3.3所列的致敏生物以外的其他传统农业生物，可判定受体生物无天然生物致敏成分。5.1.3.5对于非传统农业生物的受体生物，需要进行动物致敏性试验。外源基因对受体生物受体生物致敏性的检验（5）资料性审查（5.1）致敏性影响的检验（6）资料性审查（6.1）是否需要致敏性试验外源基因表达产物分子特性分析（6.2）YNYNNYYN图1农业转基因生物致敏性检验程序5.2动物致敏性试验5.2.1原理以BN大鼠为试验动物，采用腹腔注射的方法分别分次给予试验样品及对照样品，取血测定血浆组胺水平，并统计大鼠过敏反应级数和致敏率，判定试验样品致敏反应的强度。5.2.2试剂动物致敏性试验（5.2）依据SZJG23判定是否需要消化酶和热加工耐受性试验是否需要特异血清筛查试验消化酶和热加工耐受性试验（6.3）特异血清筛查试验（6.5）是否需要动物致敏性试验受体生物的致敏性等级动物致敏性试验（6.4）依据SZJG23判定外源基因对受体生物致敏性的影响类型依据SZJG23综合判定农业转基因生物的致敏性等级DB440300/T32.3—20073组胺测定试剂盒、EDTA-2K抗凝血剂、实验用水：按GB/T6682规定执行。5.2.3材料实验动物：6周龄，雄性BN大鼠；试验样品：以受体生物的蛋白质提取物为试验样品，以卵清蛋白为阳性对照，以自来水为阴性对照。5.2.4仪器电子天平（感量为0.001g）、恒温孵育装置、普通离心机、低温冷冻高速离心机、微型离心机、研钵及粉碎装置、低温冰箱、普通冰箱、旋涡震荡器、核酸蛋白分析仪和实验用水制备装置等。5.2.5样品蛋白质的提取制备按DB440300/T32.1规定的方法制备样品蛋白质提取物。5.2.6受试物的配制样品蛋白质提取物和卵清蛋白样品分别用水配成1mg/mL。5.2.7实验动物的分组15只BN大鼠随机分为3组，每组5只，分别为试验样品组、阳性对照组和阴性对照组。5.2.8实验动物给予受试物按无菌操作，在试验第1天经腹腔注射，分别给予试验样品组、阳性对照组和阴性对照组以试验样品、阳性对照样品和阴性对照样品，每只1mL，第7天重复一次，观察6周。5.2.9测定组胺水平取血：三组实验动物分别于第0天和第42天取血，加入EDTA-2K抗凝，离心分离血浆。组胺测定：用组胺测定试剂盒，测定各血浆样品的组胺水平，具体方法参见试剂盒说明。5.2.10结果判定5.2.10.1试验样品组动物第42天与第0天血浆组胺水平无差异，阳性对照组与阴性对照组结果正常，可判定受体生物无致敏性。5.2.10.2试验样品组动物第42天比第0天血浆组胺水平显著升高，阳性对照组与阴性对照组结果正常，可判定受体生物有致敏性。6外源基因对受体生物致敏性影响的检验6.1资料性审查6.1.1申报资料审查6.1.1.1对待检的转基因生物的外源基因（包括目的基因、报告基因和标记基因）的序列、来源及改造等资料进行审查，分析外源基因的供体生物及食用史。6.1.1.2对待检的转基因生物的外源基因供体生物的食用致敏记录的资料进行审查，分析供体生物的致敏性及可能存在的天然生物致敏成分的名称及分布状态。6.1.1.3对待检的转基因生物的目的基因的设计功能等相关资料进行审查，分析目的基因导入受体生物基因组后，对受体生物中天然生物致敏成分预期产生的作用。6.1.2信息检索6.1.2.1检索外源基因供体生物在国内外食用时间、范围、方法等相关信息。6.1.2.2应用国际通用的生物信息学数据库（同5.1.2），检索外源基因供体生物的致敏性及可能存在的天然生物致敏成分的名称、分布状态、分子量、氨基酸序列、分子特性及相关基因序列。6.1.3结果判定6.1.3.1外源基因的全序列来源于在国内或国外有长期食用史的生物，或者外源基因的全序列与国内外已批准应用于转基因生物的外源基因的序列相同，可判定外源基因的供体生物为传统农业生物；外源基因的全序列来源于在国内外均无食用史的生物，或者仅在国外少数国家有食用史，或者仅在国内少数地区有食用史的生物，可判定外源基因的供体生物为非传统农业生物。DB440300/T32.3—200746.1.3.2外源基因的序列仅部分来源于传统农业生物，或者外源基因的序列来源于对生物原有基因的改造（包括DNA片段的拼接、碱基置换、碱基插入或碱基删除等），或者外源基因的全序列与国内外已批准应用于转基因生物的外源基因的序列不同，可判定外源基因的供体生物为非传统农业生物。6.1.3.3外源基因的全序列来源于花生、大豆、鱼、贝类、小麦、坚果、奶牛（主要致敏源是牛奶）、家禽（主要致敏源是禽蛋）或数据库登录的含有天然生物致敏成分的其他生物，可判定外源基因的供体生物有天然生物致敏成分；外源基因的全序列来源于本部分所列的致敏生物以外的其他生物，可判定供体生物无天然生物致敏成分。6.1.3.4目的基因的设计功能为消除或者降低受体生物中天然生物致敏成分，可判定目的基因的导入预期具有消除或者降低受体生物中天然生物致敏成分的作用；目的基因的设计功能与受体生物中天然生物致敏成分的存在种类或含量无关，可判定目的基因的导入不改变受体生物中天然生物致敏成分的种类或含量。6.2外源基因表达产物分子特性分析6.2.1序列同源性分析6.2.1.1搜索同源基因根据外源基因核苷酸序列，应用GenBank的Blast功能搜索同源基因。6.2.1.2序列同源性分析如有同源基因，获取同源基因的编号、名称及其表达产物的名称、分子量和氨基酸序列（不包含前导序列）；根据外源基因和同源基因表达产物的氨基酸顺序（不包含前导序列），按每80个氨基酸为一组，将表达产物分为若干个比较单位；应用EMBL中氨基酸序列同源性分析软件，对外源基因和同源基因的表达产物的氨基酸序列进行比对分析。6.2.2性状相似性分析应用国际通用的生物信息学数据库（同5.1.2），检索外源基因表达产物的分子大小、等电点、水溶性及糖基化等参数。6.2