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ICS65.020.20B62备案号：31252-2011江苏省地方标准DB32DB32/T1852—2011非洲菊种苗组培快繁技术规程TechnicalRegulationforTissueCultureandPropagationofGerberajamesonii2011-08-15发布2011-10-15实施江苏省质量技术监督局发布DB32/T1852—2011I前言为规范非洲菊种苗的组培快繁方法，特制定本标准。本标准按GB/T1.1-2009《标准化工作导则第1部分：标准的结构和编写》的规定编写。本标准由江苏省农业科学院提出。本标准起草单位：江苏省农业科学院。本标准主要起草人：邓衍明、叶晓青、佘建明、汤日圣、童红玉。DB32/T1852—20111非洲菊种苗组培快繁技术规程1范围本标准规定了非洲菊（Gerberajamesonii）种苗组培快繁的设施设备和操作流程。本标准适用于非洲菊组培苗的生产。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的，凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本标准。GB/T19165—2003日光温室和塑料大棚结构与性能要求3设施设备3.1场地选择交通便捷、地势平坦、光照充足、通风良好、水电配套、排灌便利的场地进行设施建设。3.2主要设施3.2.1准备室用于玻璃、塑料器皿及其他实验用具的清洗、干燥和保存，药品的称量、溶解、配制，培养基的配制、分装、包扎和灭菌，以及植物材料的预处理、培养材料的观察分析等。3.2.2接种室放置超净工作台，开展植物材料的无菌操作，包括外植体（即由活体植物上切取下来以进行离体培养的那部分组织或器官）的消毒、接种和培养物的转接等。3.2.3培养室用于接种材料的无菌培养和观察，一般要求温度在25±2℃，光照强度2000Lux～3000Lux，光照周期14h/10h（光/暗）。3.2.4温室用于试管苗的炼苗、移栽和生长，根据实际情况可选择玻璃温室或薄膜温室，必须具备夏季可调节室内温度至32℃以下，冬季可调节室内温度至15℃以上的条件，可以喷水补湿，并且具有良好的防虫隔离条件。设施建造按GB/T19165-2003中规定执行。3.3主要设备DB32/T1852—201123.3.1准备室设备蒸馏水器、冰箱、培养箱、天平、电热磁搅拌器、酸度计、高压蒸汽灭菌锅、烘箱。3.3.2接种室设备超净工作台（水平送风）、双筒实体显微镜或生物显微镜、空调、紫外灯或空气净化装置。3.3.3培养室设备培养架、紫外灯或空气净化装置、空调、温（湿）度自动记录仪。4操作流程4.1接种前准备工作4.1.1培养基配制和灭菌以MS培养基为基本培养基，添加琼脂6.0g/L～6.5g/L，蔗糖30g/L，调节PH值为5.8；激素的具体用量和比例应根据不同培养基类型、品种特性及其在培养中的表现加以适当调整和优化。诱导愈伤培养基成分为：MS+BA0.5mg/L～1.0mg/L+IBA0.02mg/L～0.05mg/L；分化培养基成分为：MS+BA1.0mg/L～2.0mg/L+IBA0.2mg/L～0.5mg/L；增殖培养基成分为：MS+BA0.1mg/L～0.5mg/L+NAA0.01mg/L～0.05mg/L；生根培养基成分为：MS+NAA0.1mg/L～0.3mg/L+IBA0.1mg/L～0.3mg/L。培养基配制完毕后，分装至组培瓶中，在121℃下高压灭菌15min～20min，并尽快取出使其冷却备用。4.1.2超净工作台消毒接种前半小时用70%酒精喷雾或用紫外灯照射20min并通风，对超净工作台消毒。在点燃酒精灯的情况下严禁用酒精喷雾。4.1.3对接种人员的要求接种人员应牢固树立无菌操作意识，并严守以下几点：①入无菌室前洗手，洗净指甲中的污物。②入室时穿戴上经过消毒的工作服、帽子、口罩和鞋子等。③操作前和操作中经常用70%酒精棉球擦手。4.2外植体接种4.2.1外植体选取和清洗选择生长健壮、无病虫害的植株作为母株，以其花托为外植体。外植体在加有适量洗衣粉的自来水中浸泡刷洗后，用自来水冲洗20min～30min。4.2.2接种工具的消毒将刀和镊子等接种工具浸入95%酒精中，使用之前进行燃烧灭菌，然后放凉备用。此操作应在接种过程中多次重复进行，以防污染材料。燃烧时应注意浸入酒精的一端斜向下进行，不可倒置，防止烧伤。DB32/T1852—201134.2.3外植体的灭菌将外植体置于已灭菌的超净工作台上，用无菌的吸水纸吸去水分，放入70%酒精中表面灭菌15秒，然后再用0.1%的升汞灭菌8min～10min，无菌水浸洗3次～5次。消毒时间应根据生长季节和材料的带菌程度灵活调整，如果接种后污染严重则相应增加灭菌时间。4.2.4材料切割剥去包被的花苞、花瓣后，将花托放在无菌滤纸上进行切割操作，先用解剖刀分别沿花托上、下端横切1刀，切去筒状小花和花梗等组织，再十字形纵切2刀，使花托分成4个部分用于接种。4.2.4接种接种时以左手拿培养瓶，用右手轻轻取下盖子；将培养瓶口靠近酒精灯火焰处，保存瓶口倾斜，然后用镊子将材料送入瓶中。接种外植体所用培养基为诱导愈伤培养基，使花托正置于培养基上，并使其下端和培养基紧密接触。接种材料在培养容器内的分布要均匀，接种完毕立即盖好瓶盖并作好标记，注明材料名称、接种日期等事项。4.2.5接种后管理接种结束后将组培瓶整齐、均匀摆放在培养架上。培养期间定期观察培养物的生长情况，并作好记载；如发现污染物，应立即取出，待高压灭菌后清洗或丢弃。4.3分化培养待愈伤组织生长到相当于接种花托3倍～5倍体积时，即可进行分化培养以诱导不定芽。将愈伤组织切割成5mm左右见方的小块，均匀接种于分化培养基表面。其他要求同外植体接种部分。4.4增殖培养将分化的不定芽从愈伤组织上切下，并使芽的基部插入增殖培养基中，注意不可过深。一般4周～5周继代一次，直至增殖的小苗达到需要的数量。其他要求同外植体接种部分。4.5生根培养将增殖的芽丛切割成单个完整的幼芽，并使其基部插入生根培养基中。一般生根培养3周～4周能发育出完整的根系，即可用于炼苗和移栽。其他要求同外植体接种部分。4.6炼苗移栽4.6.1炼苗移栽前3天，打开根系发育良好组培苗的瓶盖，加注少量无菌水（水深0.5cm左右）炼苗。移栽前1天，将培养瓶移至温室中接受散射阳光的照射。4.6.2基质使用专用育苗基质，移栽前1天填充穴盘并喷水备用。DB32/T1852—201144.6.3移栽取出试管苗，以一手的拇指和食指轻捏茎叶部，在流水下轻轻洗净根部附着的琼脂。一定要尽量减少对根系的伤害。移栽时每穴栽1苗，栽后及时浇透水。4.6.4灭菌移栽后立即喷施一遍800倍～1000倍的多菌灵、百菌清或托布津等水溶液灭菌，以防小苗感病。