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ICS65.020.30B41备案号：江苏省地方标准DBDBDBDB32323232DB32/T1769—2011马链球菌兽疫亚种的检测PCR方法MethodofPCRfordetectingStreptococcuszooepidemicus2011-05-06发布2011-07-06实施江苏省质量技术监督局发布DB32/T1769—2011I前言为规范马链球菌兽疫亚种分子生物学检测技术，提高马链球菌兽疫亚种检测的灵敏度、稳定性、特异性，特制定本标准。本标准按GB/T1.1-2009《标准化工作导则第1部分：标准的结构和编写》编写。本标准的附录A为规范性附录。本标准由江苏省农业科学院提出。本标准起草单位：江苏省农业科学院。本标准起草人：倪艳秀、何孔旺、吕立新、张雪寒、周俊明、俞正玉、茅爱华、温立斌、郭容利、李成仁、李彬、王小敏。DB32/T1769—20111马链球菌兽疫亚种的检测PCR方法1范围本标准规定了马链球菌兽疫亚种的检测PCR方法所用的仪器设备和主要试剂、引物、方法步骤、结果判定、废弃物处理和防止污染的措施等技术标准。本标准适用于马链球菌兽疫亚种的PCR检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的，凡是注日期的引物文件，仅注日期的版本适用于本文件，凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682-2008分析实验室用水规格和试验方法3原理PCR（PolymeraseChainReaction）即聚合酶链式反应，是指在DNA聚合酶催化下，以母链DNA为模板，以特定引物为延伸起点，通过变性、退火、延伸等步骤，体外复制出与母链模板DNA互补的子链DNA的过程。是一项DNA体外合成放大技术，能快速特异地在体外扩增任何目的DNA。本标准根据GenBank上公布的马链球菌兽疫亚种类M蛋白基因序列，在其保守区设计一对特异性引物，经过了PCR条件的优化、特异性实验、敏感性实验等，对马链球菌兽疫亚种的鉴定具有很高的准确性。4仪器设备和主要试剂4.1仪器设备4.1.1高速离心机4.1.2水浴锅4.1.3PCR仪4.1.4核酸电泳仪4.1.5凝胶成像系统4.2主要试剂除另有规定，所用试剂均为分析纯。4.2.1生理盐水4.2.2蛋白酶K4.2.3Taq酶4.2.4dNTP4.2.5琼脂糖，电泳级5引物DB32/T1769—20112上游引物：5′-GCAGCCCTCTTGGTTGGT-3′；下游引物：5′-CTGCGTCAGCGTCTCCAT-3′。6方法步骤试验用水：按照GB/T6682-2008三级水标准。6.1样品处理6.1.1病料样品处理采用差速离心法：取约5g病料，剪碎研磨，用5mL生理盐水混悬，先2000r/min离心2min，去除大组织块，取上清液，后10000r/min离心5min，弃上清液，沉淀以灭菌水重悬，备用。6.1.2可疑培养物样品处理取可疑培养物1mL10000r/min离心5min，弃上清，沉淀以200µL灭菌水重悬，备用。阴性对照：液体培养基。阳性对照：马链球菌兽疫亚种液体培养物。阴性、阳性对照也同样处理，对每个样品进行编号标记。6.2DNA提取取ddH2O溶解的样品，每200µL加入3µL蛋白酶K（20mg/mL），42℃作用1h，煮沸5min，10000r／min离心5min，上清作为模板。6.3PCR扩增6.3.1反应条件按25µL体系进行，10×buffer2.5µL，MgCl2（25mM）1.5µL，dNTP（2.5mM）1.0µL，上游引物（50pmol/µL）0.5µL，下游引物（50pmol/µL）0.5µL，模板DNA3.0µL，Taq酶（5U/µL）0.5µL，灭菌水15.5µL。按如下条件进行PCR反应。95℃5min，然后进入循环94℃1min，60.2℃1min，72℃1min，35个循环，于72℃延伸10min，4℃保存。6.3.2电泳将PCR反应产物于1.0%琼脂糖凝胶进行电泳，电压为120V，时间30min。6.3.3结果观察用凝胶成像系统观察结果，并进行拍照。7结果判定7.1试验结果成立条件阳性对照的PCR产物电泳后在364bp的位置上出现一条特异性条带，阴性对照PCR产物电泳后没有条带，试验结果成立；否则，结果不成立。7.2结果判定7.2.1在试验结果成立的前提下，如果检测样品中PCR产物电泳后在364bp的位置上出现一条特异性条DB32/T1769—20113带，判为阳性，即该样品为马链球菌兽疫亚种核酸阳性。7.2.2在试验结果成立的前提下，如果检测样品中PCR产物电泳后在364bp的位置上未出现一条特异性条带，判为阴性，即该样品为马链球菌兽疫亚种核酸阴性。7.2.3如果阳性对照无相应的目的条带，可能是存在操作失误，该试验需要做重复试验；如果阴性对照有相应的目的条带，可能是阴性对照存在污染或是操作失误，该试验需要做重复试验。8废弃物处理和防止污染的措施检测过程中的废弃物，应收集后高压灭菌处理。检测过程中防止交叉污染的措施见附录A。DB32/T1769—20114附录A(规范性附录)检测过程中防止交叉污染的措施A.1抽样和制样过程抽样和制样工具，应清洗干净，121℃,15～20min灭菌，一套清洁工具限于一个样品使用。存放样品的容器应该经过清洗、灭菌，或为一次性灭菌容器。A.2检测过程A.2.1PCR实验室应分为样品制备区、前PCR区、PCR区、后PCR区。将模板提取、PCR反应液配制、PCR循环扩增及PCR产物的鉴定等步骤分区或分室进行。实验室的运作应从“净区”到“脏区”单方向进行。A.2.2实验过程中，应穿实验服和戴手套，手套要经常更换。各区要有专用实验服，经常清洗。A.2.3各区所有的试剂、器材(尤其是移液器)、仪器都应专用，不得带出该区。A.2.4所有溶液、水、耗材和器具要121℃,15～20min灭菌，避免核酸和(或)核酸酶污染。每种溶液应使用高质量的成分和新蒸馏的双蒸水。在20～25℃贮存的试剂中，可加0.025%的叠氮钠。所有试剂应该以大体积配制，然后分装成仅够一次使用的量进行贮存。A.2.5装有DNA模板或引物的离心管打开之前，要简短离心，离心管不能用力崩开，以免产生气溶胶。A.2.6前PCR区中，最好能在PCR操作箱中加人PCR反应各组分。A.2.7实验前后，实验室用紫外线消毒以破坏残留的DNA。A.2.8可使用UDG和dUTP系统控制污染。