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17721772ICS65.020.30B22备案号：江苏省地方标准DBDBDBDB32323232DB32/T1772—2011副猪嗜血杆菌病诊断技术DiagnosticTechniquesforHaemophilusparasuis2011-05-06发布2011-07-06实施江苏省质量技术监督局发布DB32/T1772—2011I前言为规范副猪嗜血杆菌病的诊断技术，特制定本标准。本标准按GB/T1.1—2009《标准化工作导则第1部分：标准的结构和编写》编制。本标准由江苏省农业科学院提出。本标准起草单位：江苏省农业科学院。本标准起草人：刘茂军、邵国青、周勇岐、王海燕、冯志新、孙佩元、甘源。DB32/T1772—20111副猪嗜血杆菌病诊断技术1范围本标准规定了副猪嗜血杆菌病诊断技术要求。本标准规定的分离鉴定和PCR法适用于本病的确诊，间接血凝试验适用于大批量样品的普查。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修订单）适用于本文件。GB16548病害动物和病害动物产品生物安全处理规程GB/T6682—2008分析实验室用水规格和试验方法NY/T541动物疫病实验室检验采样方法3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1副猪嗜血杆菌病副猪嗜血杆菌病，又称格拉泽氏病或革拉泽氏病(Glasser’sdisease)，该病由副猪嗜血杆菌（Haemophilusparasuis,HPs）引起，可以影响各年龄段猪，主要在断奶前后和保育阶段发病，通常见于5～8周龄的猪，表现为猪的纤维性多发性浆膜炎、关节炎、胸膜炎和脑膜炎等。4诊断据流行病学、临床症状和特征病变可作出初步诊断，典型病变PCR检测病原可确诊。4.1流行性病学诊断副猪嗜血杆菌只感染猪，感染2周龄到4月龄的青年猪，主要在断奶前后和保育阶段发病，通常见于5周龄～8周龄的猪，发病率一般在10%～15%，严重时死亡率可达到50%。在敏感猪群内，副猪嗜血杆菌引起的死亡主要发生在幼猪。4.2临床诊断由副猪嗜血杆菌引起的急性型疾病是非特异性的但却是特征性的，临床症状包括发热、食欲不振和厌食，严重时可见呼吸困难、发绀、不愿活动、关节肿胀、跛行、运动不协调以及死亡。急性发病耐过猪可以痊愈,但病症严重，猪耐过后往往表现慢性病症，主要是被毛粗乱、咳嗽、呼吸困难和生长迟滞。有些猪由于发生脑膜炎而表现肌肉震颤、麻痹和惊厥，有些因腹膜粘连而常引起肠梗阻。DB32/T1772—201124.3病理变化肉眼可见的损伤主要是在单个或多个浆膜面，可见浆液性和化脓性纤维蛋白渗出物，这些浆膜包括腹膜，心包膜和胸膜，这些损伤也可能涉及脑膜和关节表面，尤其是腕关节和跗关节。胸腹腔积液或粘连，关节肿胀、关节腔粘液增多，肺脏出血、表面有纤维素性渗出物附着，全身淋巴结水肿、出血。在显微镜下观察渗出物，可见纤维蛋白，中性粒细胞和较少量的巨噬细胞。病死猪及病料应符合按GB16548的规定。5病原学诊断除另有规定，所用试剂均为分析纯，水为符合GB/T6682—2008的灭菌二级水。5.1病原分离与鉴定5.1.1材料准备巧克力琼脂平板，鲜血琼脂平板，TSA固体培养基，TSB液体培养基，副猪嗜血杆菌标准菌株，细菌微量生化鉴定管，灭菌棉拭子等。5.1.2病料采集按NY/T541规定的方法，采集呼吸道分泌物，采取具有特征的肺脏、肝脏、脾脏、胸膜、胸腹腔积水、心包积液、心血、关节液和脑组织。5.1.3病原分离采集样品，首先在巧克力琼脂平板、TSA固体培养基、鲜血琼脂平板上分别划线接种，37℃培养48h～72h以后挑取单个菌落，再进行纯培养并鉴定。细菌涂片，革兰氏染色镜检。如果为革兰氏阴性小杆状或多形性小杆菌，再进行一次巧克力琼脂亚克隆培养，同时接种鲜血琼脂平板和普通琼脂平板。巧克力琼脂平板生长良好，而鲜血琼脂平板和普通琼脂平板没有菌落生成则菌株保存待进一步鉴定。5.1.4病原鉴定5.1.4.1生长特性试验挑取被检分离株和副猪嗜血杆菌标准株菌落接种绵羊鲜血琼脂平板和2%胨琼脂平板上，再以金黄色葡萄球菌点种或垂直划线，置37℃培养48h。观察葡萄球菌菌落周围菌落生成情况，如愈靠近金黄色葡萄球菌菌落生成的半透明菌落愈大，愈远的愈小，甚至不见菌落生长，且不出现溶血现象判为阳性。5.1.4.2生化实验培养物接种于添加有NAD的脲酶、氧化酶、吲哚，接触酶、葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、果糖、核糖、半乳糖、硝酸盐还原酶等细菌微量生化鉴定管，置37℃培养48h。按细菌微量生化鉴定管说明书判定。脲酶试验、氧化酶试验、吲哚试验均阴性，并接触酶、葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、果糖、核糖、半乳糖、硝酸盐还原试验均阳性者判为副猪嗜血杆菌阳性。5.1.4.3聚合酶链式反应（PCR）DB32/T1772—20113按5.2进行操作和判定。5.1.5结果判定以上实验皆为阳性判为副猪嗜血杆菌。5.2聚合酶链式反应（PCR）5.2.1材料准备PCR引物P15`-GTGATGAGGAAGGGTGGTGT-3`和P25`-GGCTTCGTCACCCTCTGT-3`，PCR相关试剂。副猪嗜血杆菌标准菌株DNA提取物为阳性对照，水作为阴性对照。高速离心机（10000r/min）、PCR仪、电泳仪、水平电泳槽凝胶成像系统（或紫外投射仪）、移液器等仪器。5.2.2DNA模板的制备按NY/T541规定的方法，采集待检猪的病料置于-20℃保存。取约1g病料，剪碎后匀浆器加5mL水研磨成糊状，煮沸10min，高速10000r/min离心5min，取上清-20℃保存备用。另外，按GB16548规定处理待检猪。取可疑培养物10000r/min离心5min，弃上清，沉淀以无菌水重悬，煮沸10min，高速10000r/min离心5min，取上清-20℃保存备用。分离纯化的菌株用接种环刮取2个菌落洗脱于含100μL无菌水的离心管，煮沸10min，高速10000r/min离心5min，取上清-20℃保存备用。5.2.3PCRPCR反应体系：10×PCRBuffer2.5μL，Mg2+（25mM）1.3μL，P1（20pmol/μL）1.0μL，P2（20pmol/μL）1.0μL，dNTPs（2.5mM）2.0μL，TaqDNA聚合酶（5U/μL）0.5μL，模板2μL～5μL，加ddH2O至总体积25μL。反应条件：94℃5min，94℃30s，59℃30s，72℃45s，34个循环，72℃10min。5.2.4电泳制备1%琼脂糖凝胶，内加适量溴化乙锭或其替代物，取PCR产物10μL～20μL分别与适量加样缓冲液混合后，加样到鸟叫孔中，9V/cm恒压下电泳15min～30min。将电泳好的凝胶放到紫外投射仪或凝胶成像系统上观察结果。5.2.5结果判定阳性对照扩增到821bp条带，同时阴性对照为扩增到条带时，试验成立。在试验结果成立的前提下，如果样品扩增到821bp条带，可确认为可疑培养物或分离纯化的菌株副猪嗜血杆菌PCR阳性。6间接血凝试验（IHA）6.1材料准备6.1.196孔V型（110°）有机玻璃反应板、25μL微量移液器、微量振荡器等。6.1.2副猪嗜血杆菌纯化灭活抗原、副猪嗜血杆菌标准阳性血清、副猪嗜血杆菌标准阴性血清。6.1.3致敏红细胞:为副猪嗜血杆菌灭活抗原致敏的绵羊红细胞。DB32/T1772—201146.1.4稀释剂:含1%健康兔血清pH7.2PBS。6.2操作方法6.2.1血清的处理取被检血清0.2mL于无菌小试管中，56℃水浴30min灭活，冷却后加入0.3mL2%戊二醛红细胞悬液，摇匀，置37℃水浴3min，离心后吸出血清供检验用。阳性血清、阴性血清的处理同被检血清。6.2.2间接血凝试验（IHA）用微量移液器先向反应板每孔中加25μL稀释剂，再向第1孔加人25μL已处理好的被检血清，充分混匀后，吸取25μL加入第2孔……，依次做倍比连续稀释至第6孔（血清的稀释倍数为1:2、1:4、1:8、1:16、1:32、1:64），混匀后从第6孔取出25μL弃去。向每孔中加入25μL2%致敏红细胞，血清的最终稀释倍数为1:4、1:8、1:16、1:32、1:64、1:128。同时应设阴、阳性血清对照及致敏红细胞空白对照。置微型振荡器上震荡30s后，室温静置2h，观察结果。6.3结果判定6.3.1成立条件致敏红细胞对照无自凝现象，阳性对照血清抗体价1:32；阴性对照血清抗体价1:16时表明试验成立。6.3.2判定标准++++:红细胞100%凝集，在孔底凝集浓缩成团，面积较大；+++:红细胞75%凝集，在孔底形成较厚层凝集，面积较大，卷边或呈锯齿状；++:红细胞50%凝集，其余不凝集的红细胞在孔底中央集中成较大的圆点；+:红细胞25%凝集，不完全沉于孔底，周围有散在少量的凝集；-:红细胞呈点状沉于孔底，周边光滑。6.3.3判定被检血清效价大于1:32为阳性；低于1:16为阴性；在1:16～1:32之间为可疑。7最终结论判定下列任何情况之一，均可判为副猪嗜血杆菌感染猪：a）发病不分年龄、季节、个体临床表现明显，病例解剖病变典型，用第5章中任何一种实验确诊为副猪嗜血杆菌阳性者；b）临床症状和发病情况不详，群体解剖检查病变典型，用第5章中任何一种实验确诊为副猪嗜血杆菌阳性者；c）发病情况、临床症状、病理变化不详，如用第5章中任何一种实验确诊为副猪嗜血杆菌阳性者；d）未免疫过副猪嗜血杆菌疫苗，如用第6章中实验确诊为副猪嗜血杆菌抗体阳性者。