DB32∕T 1598-2010 麦类赤霉病菌对多菌灵抗药性检测技术规程

ICS65.020.20DB32B22备案号：28242-2010江苏省地方标准DB32/T1598—2010麦类赤霉病菌对多菌灵抗药性检测技术规程TechnicalSpecificationforDetectingResistanceofFusariumspp.tocarbendazim2010-06-23发布2010-08-23实施江苏省质量技术监督局发布DB32/T1598—2010前言本标准按GB/T1.1-2009《标准化工作导则第1部分：标准的结构和编写》的规定编写。本标准由江苏省农药检定所提出。本标准由江苏省农药检定所和江苏丘陵地区镇江农科所起草。本标准主要起草人：沈迎春、朱金连、潘以楼。DB32/T1598—20101麦类赤霉病菌对多菌灵抗药性检测技术规程1范围本标准规定了麦类赤霉病菌对多菌灵抗药性检测的术语和定义、标样的采集、病原菌的分离、抗药性检测的方法和抗药程度的分级标准等。本标准适用于检测麦类赤霉病菌对多菌灵、甲基硫菌灵等苯并咪唑类杀菌剂的抗药性检测。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。NY/T1667.1～1667.8-2008农药登记管理术语3术语和定义下列术语和定义适用于本标准。3.1抗药性指数ResistanceIndex所检测菌株对苯并咪唑类杀菌剂的敏感性参数与其野生敏感菌株对同一杀菌剂的敏感性参数之比值；常用药剂有效中浓度参数EC50表示。3.2最低抑制浓度MinimumInhibitoryConcentration,简写MIC对病原菌产生100%效用的最低药剂浓度。3.3有效中浓度MedianEffectiveConcentration，简写EC50对病原菌产生50%效用时的药剂浓度。4所需仪器和培养基配制4.1仪器培养皿（Φ90mm），三角瓶，高压灭菌锅，超净工作台，高温恒温箱（50℃～300℃之间），恒温培养箱（使温度保持在15℃～35℃之间）、显微镜、高压灭菌锅、铝锅、量筒、试管、移液管、“L”型玻棒、剪刀、镊子等。4.2培养基配制和灭菌方法4.2.1马铃薯蔗糖琼脂培养基(PotatoSucroseAgar,简写PSA)去皮的马铃薯块200g在1000mL清水中煮沸10min，经过双层纱布过滤后的清液中加入蔗糖20g，琼脂15～20g，再煮沸至琼脂完全溶解，再经过双层纱布过滤后用清水定溶至1000mL，分装入三角瓶中，在DB32/T1598—20102高压灭菌锅中灭菌20min。备用。4.2.2水琼脂培养基(WaterAgar,简写WA)在1000mL蒸馏水中加入琼脂15～20g，煮沸至琼脂完全溶解，再经过双层纱布过滤后装入三角瓶中，在高温、高压灭菌锅中灭菌20min，冷却后备用。4.2.3多菌灵母液的配制(carbendazim)95%以上的多菌灵原药（TC）用0.2mol/LHCl溶液溶解成浓度为10000µg/mL的母液，常温下保存。4.2.4含多菌灵的PSA和WA培养基的配制PSA或WA培养基加热溶解后，在100mL培养基中加入不同量的多菌灵母液（母液的多菌灵含量为10000µg/mL），充分摇均后倒入灭菌后的培养皿中，制成含多菌灵系列浓度的PSA平皿或WA平皿。为了防止细菌污染，也可以在配制含多菌灵的PSA平板或WA平板时加入氯霉素和链霉素各50µg/mL，即先用灭菌水分别将氯霉素和链霉素溶解成5000µg/mL溶液，将PSA培养基加热溶解后，在100mL培养基中加入多菌灵母液后，待培养基冷却到50℃左右时，加入氯霉素和链霉素母液各1mL，充分摇匀后立即倒入灭菌的培养皿，制成含多菌灵及氯霉素和链霉素的检测培养基。5样本的采集和分离5.1病穗样本的采集和分离在小麦灌浆至成熟期，按不同检测目的，在用药前或用药后随机采集赤霉病病穗，每块田随机采30～40个病穗，每个病穗需间隔30～50m，每个地点采集10～20块麦田，采集的病穗单穗分装于干净的纸质样品袋内，防止交叉污染。样本带回室内直接挑取霉层进行测定或进行单孢分离、培养后测定。5.2子囊孢子的采集和分离在小麦抽穗前在麦田中随机采集带有赤霉病菌子实体的稻桩，每块田20个左右，每个稻桩间需间隔30～50m，每个地点采集10～20块麦田，按田块分别装于纸质样品袋内，带回室内用无菌水冲洗，分别置于培养皿内用含氯霉素和链霉素各50µg/mL的无菌水润湿的石英砂上，在15～20℃和散射光下保湿培养，待大量子囊孢子成熟时，从每个稻桩上挑取1个子囊壳，再用含上述浓度抗菌素的无菌水洗下子囊孢子，然后在1000r/min下离心洗涤3次，每次离心5min。最后再用无菌水将子囊孢子配制成103个孢子/mL的悬浮液。6检测方法6.1菌丝检测6.1.1抗性指数法从田间采集的病穗上，挑取病穗上分生孢子形成的红色霉层于PSA平板上，在25℃下培养2～3d，移取新长出的菌丝块至新的PSA平板上，并进行菌株编号，每皿移一个菌株；培养3～4d后，从菌落边缘处用打孔器制取5mm直径的菌丝块，分别移至含多菌灵0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4µg/mL的系列浓度的PSA平板上（用于测定敏感菌株的EC50），或含多菌灵灵0、1.25、2.5、5.0、10、20、40µg/mL的系列浓度的PSA平板上（用于测定抗性菌株的EC50），菌丝面朝上，每菌株重复3～4皿，25℃下培养3d，“十”字交叉法量取菌落增长直径，计算抑制菌丝生长50%的有效中浓度（EC50）。DB32/T1598—20103药剂抑菌率（%）=（（对照菌落直径-药剂处理菌落直径）/对照菌落直径）×100多菌灵浓度的对数和抑菌率的机率值进行回归分析，求出毒力回归方程：Y=a+bXY—抑菌率的机率值；X—多菌灵浓度的对数值。用上面方程计算出各菌株菌丝生长抑制50%时的多菌灵浓度，即有效中浓度EC50值抗性指数（RR）=测定菌株的EC50值/标准敏感菌株的EC50值抗性指数≥5的菌株为抗性菌株。抗性菌株（%）=（抗性菌株数/检测菌株总数）×1006.1.2最低抑制浓度（MIC值）法从田间采集的病穗上，挑取病穗上分生孢子形成的红色霉层于PSA平板上，在25℃下培养2～3d，移取新长出的菌丝块至新的PSA平板上，并进行菌株编号，每皿移一个菌株；培养3～4d后，从菌落边缘处用打孔器制取5mm直径的菌丝块，分别移至含多菌灵10µg/mL的PSA平板上，菌丝面朝上，每菌株重复3皿，25℃下培养3d，在含10µg/ml的PSA上能生长出新菌落的菌株即为抗性菌株，反之为敏感菌株。抗性菌株比例（%）=（抗性菌株数/检测菌株总数）×1006.2病穗检测法从田间采集的病穗上，挑取病穗上分生孢子形成的红色霉层，分别置于含多菌灵10µg/mL及氯霉素和链霉素各50µg/mL的PSA平板上，每个麦穗挑取一个菌株，25℃下培养2～3d，在含药培养基上长出的深红色或鲜红色菌落的菌株即为抗药性菌株，未长出菌落的即为敏感菌株。抗性菌株比例（%）=（抗性菌株数/检测菌株总数）×1006.3分生孢子检测法将田间采集的病穗单穗编号作为一个菌株，挑取红色霉层置于灭菌水中，然后振动使孢子散于水中，用灭菌水稀释成低倍显微镜下15～20个/每视野的孢子液，取0.1mL涂于含多菌灵10µg/mL和氯霉素和链霉素各50µg/mL的WA平板上，25℃下培养24h，在100×倍显微镜下检查孢子萌发后的芽管形态。分生孢子仅两端伸出芽管，且芽管顶端不膨大，即为在含药平皿上正常萌芽的分生孢子，即为抗性菌株；如分生孢子除两端伸出芽管外，在分生孢子中间细胞处也伸出芽管，且芽管顶端膨大粗短，为在含药平皿上不正常萌芽的分生孢子，即为敏感菌株。抗性菌株比例（%）=（抗性菌株数/检测菌株总数）×1006.4子囊孢子检测法将5.2方法中获得各田块的子囊孢子悬浮液，用灭菌水稀释成低倍显微镜下15～20个/每视野的孢子液，取0.1mL涂于含多菌灵10µg/mL和氯霉素和链霉素各50µg/mL的WA平板上，25℃下培养24h，在100×倍显微镜下检查孢子萌发后的芽管形态。子囊孢子仅两端伸出芽管，且芽管顶端不膨大，为在含药平皿上正常萌芽的子囊孢子，即为抗性菌的子囊孢子；如子囊孢子除两端伸出芽管外，在分生孢子中间细胞处也伸出芽管，且芽管顶端膨大粗短，即不正常萌芽子囊孢子，即为敏感菌株的子囊孢子。抗性菌株比例（%）=（抗性菌的子囊孢子数/检查子囊孢子总数）×1007结果根据统计结果进行抗性分析评价，写出抗性检测报告，并列出原始数据。