DB32∕T 1599-2010 油菜菌核病菌对苯并咪唑类杀菌剂抗药性检测技术规程

ICS65.020.20DB32B22备案号：28243-2010江苏省地方标准DB32/T1599—2010油菜菌核病菌对苯并咪唑类杀菌剂抗药性检测技术规程TechnicalSpecificationforDetectingResistanceofSclerotiniasclerotiorumtoBenzimidazoleFungicide2010-06-23发布2010-08-23实施江苏省质量技术监督局发布DB32/T1599—2010前言本标准按GB/T1.1-2009《标准化工作导则第1部分：标准的结构和编写》的规定编写。本标准由江苏省农药检定所提出。本标准由江苏丘陵地区镇江农科所和江苏省农药检定所起草。本标准主要起草人：沈迎春、朱桂梅、潘以楼、钱忠海。DB32/T1599—20101油菜菌核病菌对苯并咪唑类杀菌剂的抗药性检测技术规程1范围本标准规定了油菜菌核病菌对苯并咪唑类杀菌剂抗药性检测的术语和定义、标样的采集、病原菌的分离、抗药性检测的方法和抗药程度的分级标准等。本标准适用于油菜菌核病菌对苯并咪唑类杀菌剂——多菌灵、苯菌灵、甲基硫菌灵等抗药性检测。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。NY/T1667.1～1667.8-2008农药登记管理术语3术语和定义下列术语和定义适用于本标准3.1苯并咪唑类杀菌剂BenzimidazoleFungicide含有苯并咪唑结构或植物体中可转化为苯并咪唑、或与苯并咪唑类有相似作用机理的一类杀菌剂。3.2抗药性指数ResistanceIndex所检测菌株对苯并咪唑类杀菌剂的敏感性参数与其野生敏感菌株对同一杀菌剂的敏感性参数之比值；常用药剂有效中浓度参数EC50表示。3.3最低抑制浓度MinimumInhibitoryConcentration,简写MIC对病原菌产生100%效用的最低药剂浓度。3.4有效中浓度MedianEffectiveConcentration，简写EC50对病原菌产生50%效用时的药剂浓度。4所需仪器和培养基配制4.1仪器培养皿（Φ90mm），三角瓶，高压灭菌锅，超净工作台，高温恒温箱（50℃～300℃之间），恒温培养箱（使温度保持在15℃～35℃之间）、显微镜、高压灭菌锅、铝锅、量筒、试管、移液管、“L”型玻棒、剪刀、镊子等。4.2培养基配制和灭菌方法DB32/T1599—201024.2.1马铃薯蔗糖琼脂培养基(PotatoSucroseAgar,简写PSA)去皮的马铃薯块200g在1000mL清水中煮沸10min，经过双层纱布过滤后的清液中加入蔗糖20g，琼脂15～20g，再煮沸至琼脂完全溶解，再经过双层纱布过滤后用清水定溶至1000ml，装入三角瓶中，在高温、高压灭菌锅中灭菌20min，冷却后备用。4.2.2水琼脂培养基(WaterAgar,简写WA)在1000ml蒸馏水中加入琼脂15～20g，煮沸至琼脂完全溶解，再经过双层纱布过滤后装入三角瓶中，在高压灭菌锅中加压灭菌20min。备用。4.2.3多菌灵母液的配制(carbendazim)95%以上的多菌灵原药（TC）用0.2mol/LHCl溶液溶解成含量为10000mg/L的母液，低温下保存。4.2.4含多菌灵的PSA培养基的配制PSA培养基加热溶解后，在100mL培养基中加入多菌灵母液，充分摇均后倒入灭菌后的培养皿中，制成含多菌灵的PSA平皿。为了防止细菌污染，也可以在配制含多菌灵的PSA平板时加入氯霉素和链霉素各50mg/L，先用灭菌水分别将氯霉素和链霉素溶解成5000mg/L溶液，将PSA培养基加热溶解后，在100mL培养基中加入多菌灵母液后，待培养基冷却到50℃左右时，加入氯霉素和链霉素母液各1mL，充分摇匀后立即倒入灭菌的培养皿，制成含多菌灵及氯霉素和链霉素的检测培养基。5样本的采集和分离在油菜成熟期，按不同检测目的，在用药田块随机采集油菜病株上的菌核，每株油菜病株重采集1个菌核，病株间距30m以上，每块田采30～40个菌核，每个地点采集10～20块油菜田，每块田集中的菌核合并装入1个干净的纸质样品袋内。样本带回室内，采用菌核直接检测或用菌核培养长出菌丝后测定。从田间采集的菌核用漂白粉水溶液（漂白粉10g加入140mL水中）表面灭菌5min后直接置于PSA平板上，在22℃下培养3～5d，移取新长出的菌丝块至新的PSA平板上，进行菌株编号，每皿移一个菌株；培养2～3d后可作菌株保存或进行抗药性检测。6检测方法6.1菌丝生长抑制检测法6.1.1抗性指数法从菌核分离的菌株或室内保存的菌株移至PSA平板上，在22℃下培养2～3d后，从菌落边缘处用打孔器制取4mm直径的菌丝块，分别移至含多菌灵浓度分别为0、0.0064、0.032、0.16、0.8、4、20、100、500mg/L的PSA平板上，菌丝面朝上，每菌株重复3皿，22℃下培养2d，“十”字交叉法量取菌落增长直径，计算抑制菌丝生长50%的有效中浓度（EC50）药剂抑菌率（%）=（（对照菌落直径-药剂处理菌落直径）/对照菌落直径）×100多菌灵浓度的对数和抑菌率的机率值进行回归分析，求出毒力回归方程：Y=a+bXY—抑菌率的机率值；X—多菌灵浓度的对数值。用上面方程计算出各菌株菌丝生长抑制50%时的多菌灵浓度，即有效中浓度EC50值抗性指数（RR）=抗性菌株的EC50值/敏感菌株的EC50值DB32/T1599—20103抗性指数≥5的菌株为抗性菌株。抗性菌株比例（%）=（抗性菌株数/检测菌株总数）×1006.1.2最低抑制浓度（MIC值）法从菌核分离的菌株或室内保存的菌株移至PSA平板上，在22℃下培养2～3d后，从菌落边缘处用打孔器制取4mm直径的菌丝块，分别移至含多菌灵浓度分别为0、0.5、5、50、500mg/L的PSA平板上，菌丝面朝上，每菌株重复3皿。在22℃下培养2d，观察在各浓度平板上是否有新的菌丝体长出。计算药剂完全抑制菌丝生长的最低抑制浓度（MIC值）。经过多年研究，多菌灵完全抑制油菜菌核病菌菌丝生长的最低浓度是5μg/ml，因此，本标准以能在含5ug/ml的PSA上生长出新菌落的菌株即为抗性菌株，反之为敏感菌株。抗药性分级：MIC＜0.5敏感菌株0.5≤MIC＜5低抗菌株5≤MIC＜50中抗菌株50≤MIC＜500高抗菌株MIC≥500极高抗菌株抗性菌株比例（%）=（抗性菌株数/检测菌株总数）×1006.2菌核直接检测法从田间采集的菌核，经灭菌处理后，分别置于含多菌灵5mg/L及氯霉素和链霉素各50mg/L的PSA平板上，22℃下培养5d，在含多菌灵5mg/L的PSA培养基上长出白色菌丝的即为抗药性菌株，未长出菌丝的即为敏感菌株。抗性菌株比例（%）=（抗性菌株数/检测菌株总数）×1007结果根据统计结果进行抗性分析评价，写出抗性检测报告，并列出原始数据。