WST 590-2018 基孔肯雅热诊断

ICS11.020C59WS中华人民共和国卫生行业标准WS/T590—2018基孔肯雅热诊断Diagnosisforchikungunyafever2018-03-06发布2018-08-01实施中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会发布WS/T590—2018I目次前言................................................................................II1范围..............................................................................12缩略语............................................................................13诊断依据..........................................................................14诊断原则..........................................................................25诊断..............................................................................26鉴别诊断..........................................................................2附录A（规范性附录）基孔肯雅热血清学检测方法........................................3附录B（规范性附录）基孔肯雅热病原学检测方法........................................8附录C（资料性附录）基孔肯雅热的鉴别诊断...........................................11附录D（资料性附录）基孔肯雅热流行病学及临床表现...................................14参考文献............................................................................16WS/T590—2018II前言本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本标准起草单位：广东省疾病预防控制中心、广州市第八人民医院、中国疾病预防控制中心、中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所、东莞市人民医院。本标准主要起草人：何剑峰、张复春、李德新、王世文、王建、柯昌文、钟豪杰、殷文武、殷思纯、郭汝宁。WS/T590—20181基孔肯雅热诊断1范围本标准规定了基孔肯雅热的诊断依据、诊断原则、诊断及鉴别诊断。本标准适用于全国各级各类医疗卫生机构及其医务人员对基孔肯雅热的诊断。2缩略语下列缩略语适用于本文件。CHIKV：基孔肯雅病毒（chikungunyavirus）ELISA：酶联免疫吸附试验（enzyme-linkedimmunosorbentassay）IgG：免疫球蛋白G(immunoglobulinG)IgM：免疫球蛋白M(immunoglobulinM)RNA：核糖核酸(ribonucleicacid)RT-PCR：逆转录-聚合酶链反应(reversetranscription-polymerasechainreaction)3诊断依据3.1流行病学史发病前12d内，曾经到过基孔肯雅热流行区或居住场所或工作场所周围曾有本病发生。3.2临床表现3.2.1发热：急起高热，体温可达39℃以上，一般发热1d～7d。部分病人热退后再次出现发热，表现为双峰热，持续3d～5d恢复正常。常伴有寒战、头痛、背痛、全身肌肉疼痛，畏光，恶心、呕吐等症状。3.2.2关节疼痛：关节疼痛主要累及手腕和踝趾等小关节，也可涉及膝和肩等大关节，腕关节受压引起剧烈疼痛是本病的重要特征。急性期多个关节出现疼痛或关节炎表现，可有肿胀或僵硬，晨间较重，严重者不能活动，通常1周～3周缓解。部分病例关节疼痛可持续数月。3.2.3皮疹：发病后2d～5d，半数以上病例在躯干、四肢伸侧、手掌和足底出现红色斑丘疹或紫癜，疹间皮肤多为正常，部分伴有瘙痒感，数天后消退，可伴脱屑。3.3实验室检查3.3.1急性期血清特异性IgM抗体阳性（见附录A中A.1）。3.3.2恢复期血清特异性抗体（IgG或中和抗体）滴度比急性期升高4倍及以上，或急性期抗体阴性而恢复期抗体阳性（见附录A中A.2、A.3）。3.3.3急性期血清标本分离到基孔肯雅病毒（见附录B中B.1）。WS/T590—201823.3.4急性期血清标本检测到基孔肯雅病毒核酸（见附录B中B.2）。4诊断原则依据患者的流行病学史、临床表现及实验室检查结果进行综合判断。在从未发生过基孔肯雅热流行的地区，应以实验室检查依据为主。5诊断5.1疑似病例符合3.1，3.2.1、3.2.2和/或3.2.3，并排除登革热和/或其他发热伴出疹性疾病者。5.2临床诊断病例符合5.1，并同时符合3.3.1。5.3确诊病例符合5.1或5.2，并同时符合3.3.2、3.3.3、3.3.4中任一项。6鉴别诊断基孔肯雅热应与登革热、甲病毒（Alphavirus）感染、传染性红斑、感染后关节炎（包括风湿热）、猩红热、立克次体病（斑疹伤寒、恙虫病）、麻疹、药疹等相鉴别。参见附录C与附录D。WS/T590—20183AA附录A（规范性附录）基孔肯雅热血清学检测方法A.1酶联免疫法检测基孔肯雅病毒（chikungunyavirus，以下简称CHIKV）IgM抗体(IgM抗体捕获酶联免疫吸附试验)A.1.1原理首先用抗人IgMµ链抗体（捕获抗体）包被96孔板，如果待检血清中存在CHIKV抗IgM抗体，则与包被的捕获抗体结合，然后再与CHIKV抗原结合，最后与加入酶标抗CHIKV抗体结合，酶与显色底物相互作用就会出现显色反应。A.1.2材料和试剂材料和试剂如下：a)包被液：碳酸钠/碳酸氢钠缓冲液，pH9.6，1.59gNa2CO3和2.93gNaHCO3溶解于1L水中；b)洗液：磷酸盐缓冲液（PBS），含0.05％吐温20，pH7.2；c)封闭液：含5％奶粉和0.05％吐温20的PBS；d)包被抗体：抗人IgMμ链抗体；e)病毒抗原：灭活的纯化CHIKV抗原，无感染性；f)细胞抗原：经纯化的未感染病毒细胞培养液；g)酶标抗体：辣根过氧化物酶标记的CHIKV单克隆抗体；h)酶底物：TMB；i)终止液：2NH2SO4；j)临床标本：急性期病人血清和/或脑脊髓液标本；阳性和阴性血清对照；k)设备：平底96孔板，洗板机，酶标仪，恒温箱，单通道和多通道移液器，试剂储液槽，保鲜袋，吸水纸。A.1.3检测方法按以下步骤操作：a)用记号笔在酶标板上标记实验编号，明确每份临床标本的位置。b)用pH9.6的包被液按1∶2000比例稀释抗人IgMμ链抗体，按75µL/孔加入到96孔板的孔中，4℃孵育过夜。c)倒掉抗体包被液，把板中剩余液体在吸水纸上吸干。每孔加入封闭液200µL封闭反应板。室温孵育30min。d)用洗液在自动洗板机上洗板5次。每次洗涤要保证每孔加满洗液。e)病人血清用稀释液进行1∶100稀释，脑脊髓液进行1:10稀释，然后按50µL/孔，各加2孔，同时用稀释液按1∶100比例稀释阳性对照血清和阴性对照血清，各加2孔。37℃湿盒孵育1h。洗涤5遍。f)稀释病毒抗原和细胞抗原。每排左边1孔按50µL/孔加入病毒抗原，每排右边1孔按50µL/孔加入细胞抗原。4℃湿盒孵育过夜。洗涤5遍。WS/T590—20184g)按50µL/孔加入辣根过氧化物酶标记的单克隆抗体，37℃湿盒孵育1h，洗板5遍。h)所有孔中加50µL/孔的TMB底物液，包括1孔未加样的空白对照孔。避光室温孵育10min。抗体阳性的孔中会逐渐显示出蓝色。i)所有孔中加50µL/孔的终止液，显示蓝色的孔此时会变成黄色。把酶标板放入酶标仪中，在450nm波长处读取OD值。A.1.4结果判断结果判断规则如下：a)如果阳性对照血清病毒抗原孔的光密度（OD）值与细胞抗原孔的OD值之比≥2.1，检测结果有效；b)如果待检标本病毒抗原孔的OD值与细胞抗原孔的OD值之比≥2.1，则可判定待检标本中CHIKVIgM抗体阳性。A.1.5意义病人血清或脑脊髓液标本中CHIKVIgM抗体阳性，表示病人新近感染CHIKV，可作为病例诊断的依据。A.2间接免疫荧光法（IFA）检测基孔肯雅病毒IgG抗体A.2.1原理IFA就是先用待检血清中的特异抗体（第一抗体）与固定在玻片上的CHIKV抗原反应，如果血清中存在CHIKV特异性IgM和IgG抗体，就会与荧光标记的抗人IgM和IgG抗体（第二抗体）结合，荧光显微镜下可见有特异荧光。A.2.2材料和试剂材料和试剂如下：a)设备：10µL、100µL、200µL和1000µL移液器各一支；荧光显微镜；CHIKV抗原片（可用BHK-21、Vero或C6/36等感染细胞制备，低温、干燥、密封保存）；盖玻片；b)试剂：CHIKV抗体阳性对照血清、阴性对照血清；荧光素标记抗人IgG和IgM荧光抗体；待检患者血清标本；样品稀释液；磷酸盐缓冲液（PBS，pH7.2）；吐温20。A.2.3检测方法按以下步骤操作：a)取出抗原片，平衡至室温；b)如果检测IgG抗体，先用标本稀释液稀释待检血清，从1∶10开始，倍比稀释至所需要的滴度；c)用移液器取适量稀释标本加到每个反应区域（标本量以覆盖所有反应区为准），避免溢出和产生气泡；d)将加有标本的抗原片放置在湿盒内，37℃温箱孵育30min；e)用含2‰吐温20的PBS冲洗抗原片，然后再漂洗5min；f)取出抗原片，用吸水纸从抗原片背面和侧面擦去洗液（不得擦拭反应区域），加入适量的荧光素标记抗人IgM或IgG荧光抗体,分别用于检测IgM或IgG抗体（荧光抗体在使用前须根据说明书用PBS稀释）；g)将抗原片放置在避光的湿盒内，37℃温箱孵育30min；WS/T590—20185h)用含2‰吐温20的PBS冲洗抗原片，再将抗原片放入含有1∶8000伊文思蓝的吐温20的PBS中漂洗5min；i)取出抗原片，用吸水纸从抗原片背面和侧面擦去洗液（不得擦拭反应区域），用甘油缓冲液封片，盖上盖玻片，避免产生气泡；j)荧光显微镜下观察结果。A.2.4结果判断结果判断规则如下：a)特异性荧光颗粒在镜下呈现黄绿色，如果抗原片的细胞胞浆中呈现出均匀的颗粒状荧光，可判断CHIKV特异抗体阳性。b)根据荧光光亮度和阳性细胞在细胞总数中所占的比例可将荧光反应大致区分为“+～++++”，无特异荧光者为阴性。检测抗体滴度时，抗体滴度为特异荧光达“++”时最高血清稀释度的倒数。c)如果阳性对照显示非特异性荧光或阴性对照显示清晰的荧光，试验则不成立，需重复检测。A.2.5意义恢复期血清IgG抗体阳转，或IgG抗体滴度较急性期有4倍及以上增高，均表示病人近期感染了CHIKV，可作为病例确诊的依据。A.3蚀斑减少中和试验检测基孔肯雅病毒中和抗体A.3.1原理血清中CHIKV中和抗体可阻断病毒吸附细胞，而未被中和的病毒仍具有感染细胞的能力，可导致单层细胞病变、脱落等，形成一个局限性的变性细胞区，该区称之为蚀斑。在单层细胞上覆盖含有活性染料的营养琼脂可指示蚀斑的多少。“蚀斑”是感染了病毒的细胞，病变死亡后无法被染料染上颜色，形成空斑，而未感染病毒的细胞可被活性染料着色，通过颜色的对比可判定蚀斑量。检测血清的中和抗体时，需用已知蚀斑滴定度的参考毒株与待检血清反应，蚀斑数减少表示血清有中和活性，中和反应后能引起50％蚀斑减少的血清稀释度的倒数即为蚀斑减少中和抗体的滴度。蚀斑减少中和试验检测基孔肯雅病毒中和抗体实验应在BSL-3级实验室内进行。A.3.2材料和试