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ICS11.020C59ws中华人民共和国卫生行业标准WS/T191—2017代替WS191—1999软下疳诊断Diagnosisforchancroid2017-07-24发布2018-02-01实施中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会发布WS/T191—2017I前言本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本标准代替WS191—1999《软下疳诊断标准及处理原则》，本标准自实施之日起，WS191—1999同时废止。本标准与WS191—1999相比，主要修改如下：——标准性质由强制性改为推荐性。——标准名称改为“软下疳诊断”；——增加了术语和定义部分(见第2章)；——删除了治疗原则(见1999年版的第3章)；——删除了临床治愈(见1999年版的第4章)；——删除了管理及预防(见1999年版的第5章)；——删除了附录A中荧光抗体染色法(见1999年版的A.5)；——增加了附录A中碱性磷酸酶试验(见A.4.5)；——删除了附录B软下疳治疗方案(见1999年版的附录B)；——增加了附录B运送和分离杜克雷嗜血杆菌常用培养基(见附录B)；——增加了附录C软下疳简介(见附录C)。本标准起草单位：中国医学科学院皮肤病医院（研究所）、江苏省人民医院（南京医科大学第一附属医院）、上海市皮肤病医院。本标准主要起草人：齐淑贞、王千秋、苏晓红、蒋娟、龚向东、龚匡隆、骆丹、周平玉。本标准所代替标准的历次版本发布情况为：——WS191—1999。WS/T191—20171软下疳诊断1范围本标准规定了软下疳的诊断原则、诊断依据、诊断和鉴别诊断。本标准适用于全国各级各类医疗卫生机构及其医务人员对软下疳的诊断。2术语和定义下列术语和定义适用于本文件。2.1软下疳chancroid由杜克雷嗜血杆菌感染所致的生殖器部位疼痛性、溃疡性性传播疾病，常合并腹股沟淋巴结化脓性病变。2.2杜克雷嗜血杆菌haemophilusducreyi杜克雷嗜血杆菌为兼性厌氧菌，无运动能力，无芽胞，革兰染色阴性，短杆状，两端钝圆，长1.6µm～2µm，宽0.5µm，大多数在细胞外呈链状或鱼群状排列，少数在细胞内呈团状分布。3诊断原则根据流行病学史、临床表现及实验室检查进行综合分析，作出诊断。4诊断依据4.1流行病学史有不安全性行为史，或性伴感染史，或多性伴史。4.2临床表现潜伏期3d～14d，平均4d～7d。皮损初发为生殖器部位的炎性小丘疹，1d～2d后迅速变为脓疱，2d～3d内脓疱破溃形成疼痛性溃疡。溃疡呈圆形或卵圆形，边缘不整，基底覆以脓性分泌物，除去渗出物，基底为血管丰富的肉芽组织，有触痛，易出血；皮损周围可出现卫星状溃疡。溃疡可在1月～2月内愈合，残留瘢痕。男性好发于冠状沟、包皮、龟头、阴茎干、会阴及肛周等处；女性好发于大小阴唇、尿道口、阴道口、阴道壁、宫颈、会阴和肛周等处。WS/T191—20172原发损害出现后的1周～2周内，约50%患者出现急性疼痛性化脓性腹股沟淋巴结炎，表现为腹股沟和股淋巴结疼痛性肿大，常为单侧，也可双侧受累。肿大的淋巴结常有波动感，可自然破溃流脓，形成一长而窄的浅溃疡。4.3实验室检查（见附录A）4.3.1显微镜检查临床溃疡分泌物标本涂片革兰染色，查见革兰染色阴性短杆菌（见附录A的A.2）。4.3.2培养临床溃疡分泌物标本细菌培养（培养基制备参见附录B），生化鉴定为杜克雷嗜血杆菌（见A.3和A.4）。5诊断5.1疑似病例符合4.2，同时有或无4.1及4.3.1，并符合：（1）发生7d以上的溃疡，用暗视野显微镜检查溃疡组织液查不到梅毒螺旋体，或梅毒血清学试验阴性；（2）临床上排除溃疡为单纯疱疹病毒（HSV）感染，HSV-PCR检测或HSV抗原检测阳性。5.2确诊病例同时符合4.3.2与5.1。6鉴别诊断软下疳应与一期梅毒的硬下疳、生殖器疱疹和性病性淋巴肉芽肿等进行鉴别诊断（参见附录C的C.5）。WS/T191—20173AA附录A（规范性附录）杜克雷嗜血杆菌的实验室检查方法A.1标本采集A.1.1取材工具棉拭子或藻酸钙拭子。A.1.2取材部位生殖器溃疡或有波动感的肿大淋巴结。A.1.3皮肤黏膜损害取材用无菌棉拭子轻轻擦去溃疡表面的痂皮和污物，再用拭子采取分泌物，从溃疡基底部或边缘取材，做涂片检查或培养。A.1.4淋巴结取材选有波动的淋巴结，消毒淋巴结表面皮肤，用无菌干棉球擦干。用1mL无菌注射器配12号针头，吸取生理盐水0.25mL～0.5mL，以无菌操作穿刺淋巴结并注入盐水，再吸入注射器内，反复2次～3次后，取抽吸液做涂片检查或培养。A.2显微镜检查A.2.1材料光学显微镜、无菌拭子、载玻片、注射器、生理盐水。A.2.2方法将标本均匀轻轻地涂在干净的玻片上，然后在空气中干燥，火焰固定。A.2.3革兰染色操作步骤如下：a)将经过固定的涂片铺满结晶紫溶液，染30s～60s，迅速在流水中洗净。b)用碘液铺满涂片，染30s～60s，用流水洗净。c)用丙酮-乙醇液脱色，直到涂片无紫色脱下为止。通常要10s～20s，取决于涂膜的厚薄。避免脱色过分，否则革兰阳性菌可误认为阴性菌。很快在流水中淋洗停止脱色，将过量的水用吸水纸吸干。d)用复红液复染1min，用流水淋洗，用吸水纸吸干。A.2.4结果及解释WS/T191—20174使用10×100倍油镜检查。杜克雷嗜血杆菌为革兰染色阴性，短杆状，两端钝圆，长1.6µm～2µm，宽0.5µm，大多数在细胞外呈链状或鱼群状排列，少数在细胞内呈团状分布。因生殖器溃疡中常有多种微生物寄居，临床标本直接涂片革兰染色镜检的结果不可靠，假阳性及假阴性较高，故涂片检查只用于初步判断，不作为确诊依据。A.3杜克雷嗜血杆菌运送与分离培养A.3.1材料A.3.1.1运送培养基BM-SGA运送培养基。主要成分包括：L-谷氨酰胺、小牛白蛋白Ⅴ、3mg/L万古霉素。A.3.1.2分离培养基A.3.1.2.1改良Thayer-Martin培养基。主要成分包括：GC基础培养基粉、血红蛋白、1%IsoVitaleX增菌剂、3mg/L万古霉素。A.3.1.2.2巧克力琼脂培养基。主要成分包括：肉浸液（肉膏液）琼脂、无菌脱纤维血、3mg/L万古霉素（培养基制备参见附录B）。A.3.2培养条件将标本接种于培养基上，分区划线分离。接种了标本的培养基应置于相对湿度80%以上，培养温度33℃～35℃，5%～10%二氧化碳环境（烛缸）中培养。48h～72h观看结果。未出现阳性结果的平皿应继续观察7d后才能丢弃。A.3.3培养菌落初步鉴定A.3.3.1菌落特征：杜克雷嗜血杆菌经48h～72h培养后，可形成直径1mm～2mm菌落，菌落光滑、呈半透明状，浅灰色或黄灰色。陈旧性培养物，菌落扁平，颜色变成灰白到棕黄。用白金耳可以完整地将菌落沿琼脂表面推动，即推动试验阳性，为杜克雷嗜血杆菌菌落的典型特征。A.3.3.2革兰染色：从菌落取材做涂片，革兰染色镜检（见A.2）。A.4生化鉴定试验A.4.1氧化酶试验A.4.1.1原理：杜克雷嗜血杆菌酶系统不完善，但能产生弱氧化酶，它产生的氧离子能将氧化酶试剂（盐酸二甲基对苯胺）氧化成醌类化合物，出现弱颜色反应。但也有报告氧化酶试验阴性的菌株。A.4.1.2方法：将氧化酶试剂配制成0.5%～1.0%水溶液。将溶液滴加于可疑菌落上，观察颜色变化。A.4.1.3结果：在滴加1%盐酸二甲基对苯胺溶液后，一般于15s～20s内菌落即呈淡红色，然后逐步变成深紫蓝色，最后呈黑色。A.4.1.4临床意义：氧化酶试验、菌体形态和菌落形态是初步鉴定杜克雷嗜血杆菌的三个重要标准。A.4.2过氧化氢酶试验WS/T191—20175A.4.2.1原理：具有触酶（即过氧化氢酶）的细菌可催化过氧化氢放出初生态氧，继而形成氧分子出现气泡。A.4.2.2方法（玻片法）：挑取培养基上的菌落，置于干净的玻片上，然后加1滴3%～6%过氧化氢，立即观察结果。A.4.2.3结果：于30s内有气泡产生者为阳性。A.4.2.4临床意义：杜克雷嗜血杆菌不产生气泡因而为阴性。A.4.3卟啉试验A.4.3.1原理：用于检测细菌将盐酸δ-氨基-γ-酮戊酸转变成卟啉及卟吩胆色素原的能力。因为杜克雷嗜血杆菌是严格依赖氯化血红素生长的一种嗜血杆菌，它没有将盐酸δ-氨基-γ-酮戊酸转变成卟啉的能力，试验结果为阴性反应。A.4.3.2方法：在12mm×75mm的试管中加入0.5mL的2mmol/L盐酸-δ-氨基乙酰丙酸溶液中制备浓菌悬液（1×109/mL），将试管放在35℃～37℃孵箱中4h。再将试管于暗室中用wood灯照射，观察结果。A.4.3.3结果：出现红色荧光则表示有卟啉存在为阳性。A.4.3.4临床意义：严格依赖氯化血红素的杜克雷嗜血杆菌缺乏转变成卟啉能力，因而呈阴性。A.4.4硝酸盐还原试验A.4.4.1原理：硝酸盐还原反应包括两个方面：1)细菌在合成代谢过程中，将硝酸盐还原为亚硝酸盐和氮，再由氨转化成氨基酸和细菌内其他含氮化合物。2)在分解代谢过程中，硝酸盐或亚硝酸盐替代氧作为呼吸系统中的终末受氢体。硝酸盐的还原过程因细菌而异，杜克雷嗜血杆菌能还原培养基中的硝酸盐为亚硝酸盐，亚硝酸盐与试剂中的醋酸作用，生成亚硝酸，亚硝酸与试剂中的氨基苯磺酸作用生成重氮苯磺酸，再与试剂中的α-萘胺结合而成为N-α-萘胺偶氮苯磺酸（红色）。A.4.4.2方法：取48h的培养物制成浓菌悬液（109/mL），取0.04mL于小试管中，加入0.04mL0.05%NaNO3溶液和0.04mL的25mmol/L磷酸缓冲液（pH6.8）。在35℃水浴孵育1h。分别加入0.5%对氨基苯磺酸乙酸溶液和0.5%萘胺乙酸溶液各0.06mL，摇匀，观察。A.4.4.3结果：2min～10min内显色，出现粉红色为阳性，不出现粉红色为阴性。A.4.4.4临床意义：杜克雷嗜血杆菌硝酸盐还原试验阳性。A.4.5碱性磷酸酶试验A.4.5.1方法：在含0.5mL0.03%无酚磷酸二钠试管中制备浓菌悬液（109/mL）。将试管置37℃水浴孵育4h，加4滴0.5%2,6-二溴醌-4-氯亚胺甲醇溶液，摇匀，置室温15min。加入0.3mLn-丁醇，摇匀静置5min。观察。A.4.5.2结果：在丁醇层出现蓝紫色为阳性。A.4.5.3临床意义：杜克雷嗜血杆菌碱性磷酸酶试验阳性。A.4.6杜克雷嗜血杆菌生化试验鉴定结果嗜血杆菌氧化酶试验阳性，过氧化氢酶试验阴性，卟啉试验阴性，硝酸盐还原试验阳性，碱性磷酸酶试验阳性。WS/T191—20176A.4.7培养意义及注意事项杜克雷嗜血杆菌培养法的敏感性为60%～80%，是目前世界卫生组织推荐和诊断软下疳病人的主要实验室方法。杜克雷嗜血杆菌对环境的抵抗力很弱，为提高培养的成功率，标本的离体时间越短越好，取材后应立即接种于分离培养基。对不能及时接种到分离培养基的临床标本，应置于运送培养基，但必须在一周内转种到分离培养基上。WS/T191—20177BB附录B（资料性附录）运送和分离杜克雷嗜血杆菌培养基的制备B.1运送培养基BM-SGA制备B.1.1BM成分BM成分如下：a)磷酸氢二钠（Na2HPO4）10.0g；b)硝酸镁（magnesiumnitrate）0.1g；c)磷酸二氢钾（KH2PO4）2.0g；d)氯化钠（sodiumchloride）5.0g；e)氯化钙（CalciumChloride）0.1g；f)血红素0.2g；g)巯基乙酸钠（sodiumthiglycollate）1.0g；h)Bacto琼脂7.5g；i)蒸馏水990mL；j)调pH至7.5。B.1.2SGA成分SGA成分如下：a)二氧化硒（SeO2）0.003mg/L；b)L-谷氨酰胺（L-glutamine）3mg/L；c)万古霉素（vancomycin）3mg/L；d)牛血清清蛋白（白蛋白）2.0g/L；e)蒸馏水10mL。B.1.3配制方法SGA成分采用孔径为0.45µm滤膜过滤除菌备用。BM成分于121℃灭菌15min，待冷至50℃，无菌操作加入SGA溶液混匀，分装于带螺旋盖的无菌试管内，每管6mL，放