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第十一单元现代生物科技专题专题25基因工程（包括PCR技术）生物(天津市选考专用)A组自主命题·天津卷题组五年高考考点1基因工程的工具与操作程序1.(2018天津理综,10,14分)甲型流感病毒为RNA病毒,易引起流感大规模流行。我国科学家在2017年发明了一种制备该病毒活疫苗的新方法,主要环节如下。(1)改造病毒的部分基因,使其失去在正常宿主细胞内的增殖能力。以病毒RNA为模板,逆转录成对应DNA后,利用技术扩增,并将其中某些基因(不包括表面抗原基因)内个别编码氨基酸的序列替换成编码终止密码子的序列。与改造前的基因相比,改造后的基因表达时不能合成完整长度的,因此不能产生子代病毒。将该改造基因、表面抗原等其他基因分别构建重组质粒,并保存。(2)构建适合改造病毒增殖的转基因宿主细胞。设计合成一种特殊tRNA的基因,其产物的反密码子能与(1)中的终止密码子配对结合,并可携带一个非天然氨基酸(Uaa)。将该基因与连接后导入宿主细胞。提取宿主细胞的进行分子杂交鉴定,筛选获得成功表达上述tRNA的转基因宿主细胞。(3)利用转基因宿主细胞制备疫苗。将(1)中的重组质粒导入(2)中的转基因宿主细胞,并在补加的培养基中进行培养,则该宿主细胞能利用上述特殊tRNA,翻译出改造病毒基因的完整蛋白,产生大量子代病毒,用于制备疫苗。特殊tRNA基因转录时,识别其启动子的酶是(单选)。A.病毒的DNA聚合酶B.宿主的DNA聚合酶C.病毒的RNA聚合酶D.宿主的RNA聚合酶(4)上述子代病毒不能在正常宿主细胞中增殖,没有致病性,因此不经灭活或减毒即可制成疫苗。与不具侵染性的流感病毒灭活疫苗相比,该病毒活疫苗的优势之一是可引起免疫,增强免疫保护效果。答案(共14分)(1)PCR多肽(或蛋白质)(2)载体总RNA(3)非天然氨基酸(Uaa)D(4)细胞解析本题主要考查基因工程的相关知识。(1)利用PCR技术体外扩增DNA。若将基因中个别编码氨基酸的序列替换为编码终止密码子的序列,则改造后的基因转录合成的mRNA中,终止密码子提前出现,将不能控制合成完整长度的多肽(或蛋白质)。(2)目的基因只有与载体连接后才能导入宿主细胞。可提取宿主细胞的总RNA进行分子杂交鉴定,以筛选获得成功表达题述tRNA的转基因宿主细胞。(3)由(2)知,转基因宿主细胞含有的特殊tRNA基因转录的tRNA,该tRNA的反密码子可与终止密码子配对,并可携带非天然氨基酸(Uaa),所以培养基中需补加非天然氨基酸(Uaa)。病毒中的基因进行转录时,识别其启动子的酶是宿主的RNA聚合酶。(4)因该病毒疫苗具有侵染性,故可引起细胞免疫。疑难突破①由(1)中“个别编码氨基酸的序列替换成编码终止密码子的序列”可知,改造后的基因表达时不能合成完整长度的多肽。②由(2)中特殊tRNA能与终止密码子配对结合,并可携带一个非天然氨基酸(Uaa)可知,转基因宿主细胞可利用非天然氨基酸Uaa,所以培养基中需加入非天然氨基酸Uaa。③灭活了的病毒已不具有侵染性,因此,只能引起体液免疫;而具侵染性的病毒可引起细胞免疫。2.(2017天津理综,9,20分)玉米自交系(遗传稳定的育种材料)B具有高产、抗病等优良性状,但难以直接培育成转基因植株,为使其获得抗除草剂性状,需依次进行步骤Ⅰ、Ⅱ试验。Ⅰ.获得抗除草剂转基因玉米自交系A,技术路线如下图。 (1)为防止酶切产物自身环化,构建表达载体需用2种限制酶,选择的原则是(单选)。①Ti质粒内,每种限制酶只有一个切割位点②G基因编码蛋白质的序列中,每种限制酶只有一个切割位点③酶切后,G基因形成的两个黏性末端序列不相同④酶切后,Ti质粒形成的两个黏性末端序列相同A.①③B.①④C.②③D.②④(2)下表是4种玉米自交系幼胚组织培养不同阶段的结果。据表可知,细胞脱分化时使用的激素是,自交系的幼胚最适合培养成愈伤组织作为转化受体。(3)农杆菌转化愈伤组织时,T-DNA携带插入其内的片段转移到受体细胞。筛选转化的愈伤组织,需使用含的选择培养基。(4)转化过程中,愈伤组织表面常残留农杆菌,导致未转化愈伤组织也可能在选择培养基上生长。含有内含子的报告基因只能在真核生物中正确表达,其产物能催化无色物质K呈现蓝色。用K分别处理以下愈伤组织,出现蓝色的是(多选)。A.无农杆菌附着的未转化愈伤组织激素结果自交系2,4-D(2.0mg/L)6-BA(0.5mg/L)IBA(2.0mg/L)愈伤组织形成率(%)芽的分化率(%)根的诱导率(%)甲991390乙858087丙888312丁168583B.无农杆菌附着的转化愈伤组织C.农杆菌附着的未转化愈伤组织D.农杆菌附着的转化愈伤组织(5)组织培养获得的转基因植株(核DNA中仅插入一个G基因)进行自交,在子代含G基因的植株中,纯合子占。继续筛选,最终选育出抗除草剂纯合自交系A。答案(1)A(2)2,4-D乙(3)除草剂(4)BD(5) 13解析(1)利用双酶切可有效防止出现限制酶切割后的产物(目的基因、载体)发生自身环化及目的基因与载体的任意连接现象。这要求每种限制酶在Ti质粒内只有一个切割位点,含目的基因的DNA片段被两种限制酶切割形成的黏性末端碱基序列不同。(2)细胞脱分化形成愈伤组织。表格信息显示,使用了2,4-D促使细胞脱分化。作为转化受体的幼胚,不仅要易脱分化,而且还要易再分化生芽、生根,故乙的幼胚最适合培养成愈伤组织作为转化受体。(3)构建的基因表达载体中有抗生素抗性基因和除草剂抗性基因(除草剂抗性基因位于T-DNA片段上),因利用农杆菌转化法转基因时,只有T-DNA整合到植物细胞染色体DNA上,故需使用含除草剂的培养基筛选转化的愈伤组织。(4)因“含有内含子的报告基因只能在真核生物中正确表达”,只有细胞内含有报告基因(成功转化)的愈伤组织,用K处理后出现蓝色,故选BD。(5)转基因植株相当于携带G基因的杂合子,转基因植株自交,后代有3/4植株携带G基因,其中纯合子占1/3。素养解读本题通过对转基因作物及杂交育种相关知识的考查,让学生形成认识事物、解决时间问题的思维习惯和能力(体现了生命观念、科学思维、社会责任素养的考查)易错警示转基因植物培育过程中,筛选成功转化的植物受体细胞的标准利用农杆菌转化法完成植物细胞转基因时,因只有Ti质粒的T-DNA整合到受体细胞的染色体DNA上,故筛选转化的植物受体细胞只能借助T-DNA片段上的特殊基因作为筛选标准,而Ti质粒上的非T-DNA片段未导入植物受体细胞,在对转化后的受体细胞筛选时不能以此作为选择标准。3.(2015天津理综,8,16分)纤维素分子不能进入酵母细胞。为了使酵母菌能够利用环境中的纤维素为原料生产酒精,构建了含3种不同基因片段的重组质粒。下面是酵母菌转化及纤维素酶在工程菌内合成与运输的示意图。 据图回答:(1)本研究构建重组质粒时可选用四种限制酶,其识别序列如下图。为防止酶切片段的自身连接,可选用的限制酶组合是或。 A.①②B.①③C.②④D.③④(2)设置菌株Ⅰ为对照,是为了验证不携带纤维素酶基因。(3)纤维素酶基因的表达包括和过程。与菌株Ⅱ相比,在菌株Ⅲ、Ⅳ中参与纤维素酶合成和分泌的细胞器还有。答案(16分)(1)B(或C)C(或B)(2)质粒DNA和酵母菌基因组(3)转录翻译内质网、高尔基体(4)Ⅱ缺少信号肽编码序列,合成的纤维素酶不能分泌到胞外,细胞无可利用的碳源(5)细胞质基质无氧呼吸A基因片段(4)在以纤维素为唯一碳源的培养基上分别培养菌株Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ,菌株不能存活,原因是。(5)酵母菌生成酒精的细胞部位是,产生酒精时细胞的呼吸方式是。在利用纤维素生产酒精时,菌株Ⅳ更具优势,因为导入的重组质粒含有,使分泌的纤维素酶固定于细胞壁,减少因培养液更新而造成的酶的流失,提高酶的利用率。解析本题借助新情境材料考查对照实验结果分析、基因工程、分泌蛋白表达、呼吸等相关知识,考查学生获取信息能力、实验能力、理解能力。(1)为防止酶切片段的自身连接,必须用不同限制酶切割,且酶切片段两端的黏性末端不相同(不存在碱基互补片段)。从图示看,符合要求的限制酶有以下组合:①③、①④、②③、②④,B、C正确。(2)分析对照实验首先要确定自变量,本题中自变量是导入含不同基因片段的重组质粒。菌株Ⅰ为空白对照,与其他三个组别比较,不难发现设置菌株Ⅰ的目的是验证质粒自身及酵母菌原基因组不携带纤维素酶基因。(3)基因表达包括转录和翻译两个过程。通过图示来看菌株Ⅱ中,纤维素酶只分布在细胞质基质中,而菌株Ⅲ和菌株Ⅳ的纤维素酶分布在内质网、高尔基体、囊泡、细胞外,所以菌株Ⅲ、Ⅳ中参与纤维素酶合成和分泌的细胞器还有内质网、高尔基体。(4)菌株Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ进行对比,不难发现信号肽的作用是引导多肽(纤维素酶)进入内质网加工,再经高尔基体分泌到胞外,这样纤维素酶可在胞外将纤维素水解为葡萄糖,供酵母菌吸收利用。而菌株Ⅱ纤维素酶在胞内无法水解纤维素,故在以纤维素为唯一碳源的培养基上,菌株Ⅱ不能存活。(5)酵母菌无氧呼吸生成酒精,场所为细胞质基质。菌株Ⅲ和Ⅳ均能水解纤维素产生酒精,两组进行对比,菌株Ⅲ的纤维素酶流失多,菌株Ⅳ因导入A基因片段使得纤维素酶固定于细胞壁,减少因培养液更新而造成的酶的流失,酶的利用率更高。考点2基因工程的应用与蛋白质工程1.(2019天津理综,9,12分)B基因存在于水稻基因组中,其仅在体细胞(2n)和精子中正常表达,但在卵细胞中不转录。为研究B基因表达对卵细胞的影响,设计了如下实验。 据图回答:(1)B基因在水稻卵细胞中不转录,推测其可能的原因是卵细胞中(单选)。A.含B基因的染色体缺失B.DNA聚合酶失活C.B基因发生基因突变D.B基因的启动子无法启动转录(2)从水稻体细胞或中提取总RNA,构建文库,进而获得B基因编码蛋白的序列。将该序列与Luc基因(表达的荧光素酶能催化荧光素产生荧光)连接成融合基因(表达的蛋白质能保留两种蛋白质各自的功能),然后构建重组表达载体。(3)在过程①、②转化筛选时,过程中T-DNA整合到受体细胞染色体DNA上,过程在培养基中应加入卡那霉素。(4)获得转基因植株过程中,以下鉴定筛选方式正确的是(多选)。A.将随机断裂的B基因片段制备成探针进行DNA分子杂交B.以Luc基因为模板设计探针进行DNA分子杂交C.以B基因编码蛋白的序列为模板设计探针与从卵细胞提取的mRNA杂交D.检测加入荧光素的卵细胞中是否发出荧光(5)从转基因植株未成熟种子中分离出胚,观察到细胞内仅含一个染色体组,判定该胚是由未受精的卵细胞发育形成的,而一般情况下水稻卵细胞在未受精时不进行发育,由此表明。答案(共12分)(1)D(2)精子cDNA(3)②①(4)BCD(5)B基因表达能使卵细胞不经受精直接发育成胚解析(1)B基因的启动子无法启动转录,会导致B基因在水稻卵细胞中不转录。(2)利用水稻体细胞或精子中提取的总RNA,经逆转录法构建的基因文库为cDNA文库。(3)过程①需将基因表达载体导入农杆菌,所以可在培养基中加入卡那霉素以筛选成功导入了基因表达载体的农杆菌。过程②农杆菌感染水稻愈伤组织,农杆菌Ti质粒的T-DNA可整合到受体细胞染色体DNA上。(4)水稻细胞中本来就有B基因,正常植株也会出现杂交带,故A错误;B、D选项是检测Luc基因及其产物,B、D正确;C选项检测对象是卵细胞中mRNA,正常水稻植株卵细胞中无B基因的mRNA,C正确。(5)一般情况下,水稻卵细胞在未受精时不能发育成胚,而转基因植株未受精的卵细胞能发育成胚,说明B基因表达能使卵细胞不经受精直接发育成胚。素养解读本题借助基因工程相关知识,考查考生运用所学知识对某些生物学问题进行推理、解释,并作出合理判断或得出正确结论的能力;试题通过B基因表达对卵细胞的影响考查了科学思维素养中的演绎与推理要素。2.(2016天津理综,7,12分)人血清白蛋白(HSA)具有重要的医用价值,只能从人血浆中制备。如图是以基因工程技术获取重组HSA(rHSA)的两条途径。 (1)为获取HSA基因,首先需采集人的血液,提取合成总cDNA,然后以cDN