gat 383-2002 法庭科学dna实验室检验规范

ICS13.310A92GA中华人民共和国公共安全行业行业标准GA/T383—2002法庭科学DNA实验室检验规范ExaminationfortheforensicDNAlaboratory2002-04-22发布2002-07-01实施中华人民共和国公安部发布GA/T383—2002I前言本标准由全国刑事技术标准化技术委员会（CSBTS/TC179）提出并归口。本标准主要起草单位：公安部物证鉴定中心。本标准参加起草单位：上海市公安局、辽宁省公安厅、北京市公安局、广州市公安局、黑龙江省公安厅。本标准起草人：叶健、陈松、周怀谷、刘冰。中华人民共和国公安部2002-04-24批准2002-07-01实施中华人民共和国公共安全行业标准法庭科学DNA实验室检验规范GA/T383—2002ExaminationfortheforensicDNAlaborator1范围本标准规定了法庭科学DNA实验室检验应遵守的基本要求。本标准适用于所有从事法庭科学检验的DNA实验室。2定义本标准采用下列定义。2.1前期检验priorexaminationDNA检验前进行的预试验和确证试验。2.2有机溶剂法organicextractionofDNA通过酚-氯仿混合物萃取DNA溶液中的蛋白质类有机物质，而保留DNA于水相溶液中的提取方法。2.3Chelex法ChelexextractionofDNA利用Chelex能有效地去除非核酸有机物的性能而提取DNA的方法。2.4硅珠法siliconbeadtest在硫氰酸胍条件下，利用二氧化硅微粒特异捕获有机质溶液中的DNA分子的性能提取DNA的方法。2.5CTAB法cetyltrimethylammoniumbromidemethod利用非离子型去污剂十六烷基三甲基溴化胺（CTAB）具有破坏植物细胞壁和细胞膜及硬组织，并能与DNA形成复合物的能力，通过抽提使DNA与蛋白质及多糖类物质有效分离而达到提取高纯度DNA的目的。2.6聚合酶链反应polymerasechainreaction-PCR一个酶促的特定DNA片段扩增过程。3案件受理3.1刑事案件的送检人员需提供公、检、法、司，以及保卫部门的盖有公章的鉴定委托书或公函，并出示本人的工作证。民事案件的送检人员需提供委托单位或个人的委托书，并出示本人的身份证明。3.2送检人员需填写送检登记表，详细填写送检单位、送检人姓名、送检日期、简要案情、送检检材名称及特征、有无作过鉴定、原鉴定单位及原鉴定结论、鉴定要求等。3.3接案人员在了解案情和鉴定要求后，逐一确认检材，并对检材进行编号，有条件的照相固定，最后在送检登记表上签名。3.4检验人员从接案人员手中受理检材时，应详细了解案情和鉴定要求，逐一核对检材后，在送检登记表上签名。4检材的提取和保存1GA/T383—200224.1适合DNA鉴定的检材包括血液（痕）、精液（斑）、唾液（斑）、毛发、组织、骨骼等生物检材。4.2提取检材前注意记录检材的大小、形态等特征，必要时照相、录像固定。提取检材时必须戴手套。提取的检材必须分别包装，在包装袋上注明检材名称、来源、数量、采集日期等，并有采集人及采集见证人的签名。4.3对于活体检材，一般用医用消毒纱布或中速滤纸采集指血或耳垂血（2cm2以上），自然晾干。可以用口腔拭子提取口腔粘膜细胞，提取前须清水漱口，检材自然晾干；或取毛发3根~5根。以上检材均用纸袋包装后常温保存。4.4对于血痕，类似衣裤、地毯、床单上的血痕，可以剪下一部分纸袋包装后常温保存；类似衣柜、墙壁、地面、刀、斧上的血迹可以刮取，或用生理盐水浸湿的纱线提取，自然晾干后纸袋包装常温保存。4.5涉嫌性侵害的，应用棉签分别提取阴道外端、中部和后穹窿部，必要时还应注意会阴、下腹、口腔、肛门等部位有无精液（斑），以及现场怀疑有精斑的其他检材，如床单、被褥、卫生纸、避孕套、内裤、衣物等。所有检材应该分别提取、标明记号、自然晾干、纸袋包装后常温保存。4.6现场的可疑毛发用镊子提取，用纸折叠后置纸袋内常温保存。4.7含有唾液斑的检材如烟头、果核、香口胶等用镊子提取，纸袋包装后常温保存。4.8人流刮宫组织，取5g以上确认为绒毛的组织；引产胎儿，取5g以上的组织；羊水，取2ml以上的液体。提取的检材洁净容器包装、冰冻保存、冷藏送检。4.9新鲜尸体，可用医用消毒纱布或中速滤纸提取血液（3cm2以上），自然晾干，纸袋包装后常温保存。新鲜尸体也可取肌肉组织（50g以上）；腐败尸体，尽量提取相对新鲜的组织，包括指甲（2枚以上）、肋软骨（5cm以上）或者其它软骨（5g以上）、深部肌肉组织（50g以上）、毛发（10根以上）；白骨化的尸体尽可能提取指甲、长骨、牙齿、毛发。以上检材洁净容器包装、冰冻保存、冷藏送检。4.10根据案件情况，注意提取对照样本。5前期检验5.1血痕检验5.1.1预试验——联苯胺试验5.1.1.1试剂a）联苯胺无水乙醇饱和液；b）3%过氧化氢溶液；c）冰醋酸。5.1.1.2方法取滤纸轻轻擦拭斑迹，分别加冰醋酸、联苯胺无水乙醇饱和液、3%过氧化氢溶液，立即出现翠蓝色为阳性反应。5.1.2种属试验——环状沉淀试验5.1.2.1试剂a）抗人血红蛋白血清或抗人血清；b）生理盐水。5.1.2.2方法取少量血痕检材，滴入适量生理盐水制成浸出液。取试管加入抗人血红蛋白血清或抗人血清，然后小心加入上述浸出液，60分钟内两液界面间出现白色沉淀环者为阳性。5.1.3种属试验——对流免疫电泳法GA/T383—200235.1.3.1试剂a）巴比妥缓冲液；b）高电渗琼脂糖；c）抗人血红蛋白血清或抗人血清；d）双蒸馏水。5.1.3.2方法取高电渗琼脂糖和巴比妥缓冲液制成琼脂溶液，取琼脂溶液平铺于载玻片上，凝固后打两排成对的孔。取少量血痕检材，滴入适量双蒸馏水或巴比妥缓冲液制成浸出液，加入上述琼脂板负极侧孔内，在琼脂板正极侧孔内加入抗人血红蛋白血清或抗人血清，电泳30分钟～40分钟。电泳完毕后在黑色背景上方，通过斜光照射，观察两孔间形成的抗原－抗体复合物的白色沉淀线，有白色沉淀线者为阳性。5.1.4种属试验——金标试纸检验法试剂和方法以说明书为准。5.2精斑检验5.2.1预试验——酸性磷酸酶试验5.2.1.1试剂a）碳酸钙ß-萘酯；b）1-氯化重氮蒽醌；c）缓冲液：氯化钠、冰醋酸、醋酸钠。5.2.1.2方法取适量碳酸钙ß-萘酯和1-氯化重氮蒽醌溶于缓冲液制成检测试剂，取少量可疑斑迹置白瓷板凹内，滴加上述试剂，如检材确为精斑，在30s内即可见橘红色反应。5.2.2确证试验——精子检出法5.2.2.1试剂a）1%酸性复红溶液；b）1%美蓝溶液；c）1%盐酸；d）生理盐水。5.2.2.2方法取少量可疑斑迹用适量生理盐水浸泡后，涂于载玻片上，干燥后分别用1%酸性复红溶液和1%美蓝溶液染色，1%盐酸和清水洗涤，干燥后镜检。精子头部被染成红色，而尾部被染成蓝色。5.2.3确证试验——金标试纸检验法试剂和方法以说明书为准。5.3唾液斑检验5.3.1淀粉酶试验5.3.1.1试剂a）0.01%淀粉溶液；b）碘－碘化钾溶液；5.3.1.2方法取少量可疑斑迹加适量0.01%淀粉溶液，37℃温箱30分钟，加碘－碘化钾溶液，呈淡黄色和无色时为阳性反应，呈蓝色则为阴性。6DNA提取GA/T383—200246.1有机溶剂法6.1.1器材和试剂a）高速离心机；b）水浴或干浴；c）移液器d）细胞溶解缓冲液（CLB）：蔗糖，MgCl2，Tris-HCl，TritonX-100；e）蛋白溶解缓冲液（PLB）：NaCl，EDTA-Na2；f）DNA提取缓冲液：Tris-HCl、EDTA、NaCl、SDS、DTT；g）TNE缓冲液：Tris-HCl、EDTA、NaCl；h）TE缓冲液：Tris-HCl、EDTA；i）5×精子提取液：Tris-HCl、EDTA、NaCl、SDS、DTT；j）纯化试剂；k）CentriconTM-100；l）SDS；m）DTT；n）饱和酚和氯仿；o）无水乙醇和70%乙醇溶液；p）NaCl或NaAc；q）蛋白酶K。6.1.2方法6.1.2.1血液a）取适量血液加入等体积细胞溶解缓冲液，混匀至透明；b）离心后去上清液，沉淀中加入蛋白溶解缓冲液匀浆；c）加入SDS和蛋白酶K，37℃消化4小时以上；d）加入等体积的酚、酚和氯仿（1：1混合）、氯仿各提取一次后，加1/10体积的NaCl或NaAc溶液和2.5倍体积的冷无水乙醇混匀，得到团状的DNA沉淀；e）离心去上清液，沉淀中加入70%乙醇混匀；f）离心去上清液，晾干后加入TE缓冲液备用。6.1.2.2混合斑a）剪碎带有精子的检材，加入适量TNE缓冲液，37℃保温0.5小时～1小时，加入SDS和蛋白酶K，37℃保温1小时～2小时消化女性上皮细胞；b）底部带孔离心管离心分离去除载体，并去除上清液，沉淀物用TNE洗涤离心数次；c）沉淀物内加入5×精子提取液、蛋白酶K，置37℃消化3小时～4小时；d）以下同6.1.2.1d）、e）、f）。6.1.2.3组织a）取少量组织（脑、肌肉等）加入适量蛋白溶解缓冲液进行匀浆；b）加入SDS和蛋白酶K，37℃消化4小时～6小时。c）以下同6.1.2.1d）、e）、f）。6.1.2.4毛干a）将毛干剪成3mm～5mm长，无水乙醇、水、无水乙醇各冲洗一次，晾干后加入DTT、SDS、蛋白酶K、蛋白溶解缓冲液，37℃消化至完全溶解；b）加入等体积的酚、酚∶氯仿（1∶1混合）、氯仿各抽提一次，加入1/10体积的NaCl或NaAc溶液和2.5倍无水乙醇，混合后-20℃冷冻1小时以上；GA/T383—20025c）离心去上清液，沉淀中加入70%乙醇混匀；d）离心去上清液，晾干后加入TE缓冲液备用。6.1.2.5骨和牙齿a）以手术刀刮净骨骼和牙齿表面垢物，用温热蒸馏水冲洗两次，紫外光照射1小时。再用锤子将牙齿砸成粉末和用电钻取出骨松质，并将其用研磨器进一步磨碎；b）取适量骨或牙齿粉末，加入DNA提取缓冲液、蛋白酶K，于37℃消化过夜；c）酚和氯仿提取，提取液置CentriconTM-100中离心浓缩后，加1/10体积的NaCl和2.5倍无水乙醇-20℃冰箱过夜；d）离心去上清液，晾干加入TE缓冲液溶解后纯化，纯化试剂和方法以说明书为准。6.2Chelex法6.2.1器材和试剂a）高速离心机；b）水浴或干浴；c）移液器；d）Chelex-100溶液；e）TNE缓冲液f）蛋白酶K溶液；g）SDS；h）DTT溶液；i）双蒸馏水。6.2.2方法6.2.2.1血液和血痕a）取少量血液或血痕加入适量双蒸馏水，室温30分钟；b）离心后去上清液，沉淀中加入Chelex-100，56℃消化30分钟；c）煮沸8分钟，离心后4℃冰箱内备用。6.2.2.2混合斑a）剪碎带有精子的检材，加入适量TNE缓冲液，37℃保温0.5小时～1小时，加入SDS和蛋白酶K，37℃保温1小时～2小时消化女性上皮细胞；b）底部带孔离心管离心分离去除载体，并去除上清液，沉淀物用TNE离心洗涤数次；c）沉淀物内加入Chelex-100溶液、蛋白酶K和DTT溶液，置56℃消化1小时～2小时；d）煮沸8分钟，离心后4℃冰箱内备用。6.2.2.3组织a）取少量组织（脑、肌肉等）加入适量蛋白溶解缓冲液进行匀浆；b）加入Chelex-100、蛋白酶K，56℃消化2小时～3小时；c）煮沸8分钟，离心后4℃冰箱内备用。6.2.2.4唾液斑a）信封和邮票用灭菌的双蒸水润湿的棉签涂抹信封封口处和邮票背面，烟蒂直接剪取外层纸，剪碎后加入Chelex-100、蛋白酶K溶液，56℃消化1.5小时；b）煮沸8分钟，离心后4℃冰箱内备用。6.2.2.5毛发a）毛根剪取毛发的毛根部分5mm～10mm，毛干则剪成3mm～5mm长，无水乙醇、水、无水乙醇各冲洗一次，晾干后加入Chelex-100、蛋白酶K、DTT溶液，56℃消化至完全溶解；b）煮沸8分钟，离心后4℃冰箱内备用。GA/T383—200266.2.2.6骨和牙齿a）研碎的牙髓或骨髓，加入Chelex-100、蛋白