GUS染色液

GUS染色液简介：GUS(β-Galactosidase)基因是存在于E.coli等一些细菌基因组内的编码β-葡萄糖苷酸酶的一种水解酶，该基因常作为融合标记用于植物转基因分析和调控研究中。GUS受体基因系统有表达E.coliGUS酶的稳定性和在植物内的低活性，绝大多数植物没有检测到葡萄糖苷酸酶的背景活性，以β-葡萄糖苷酸酯类物质为底物，其反应产物可用多种方法检测出来。5-Bromo-chloro-3-indolylβ-D-glucuronide，cyclohexylammoniumsalt(简称为X-Gluc或X-GlcA)分子量为521.8，CAS号为18656-96-7，是检测大肠杆菌中GUS基因的底物，可快速检测植物中GUS基因融合标记。β-葡萄糖苷酶基因染色试剂盒(β-GalactosidaseReporterGeneStainingKit)简称为GUS染色液，其染色原理是适宜的反应条件下，β-葡萄糖苷酶(GUS)可将X-Gluc水解成蓝色物质，该物质不溶解于转基因的细胞核组织中的靛蓝物质，具有GUS活性的部位或位点呈现蓝色或蓝色斑点，可用肉眼或显微镜观察到。GUS染色液可用于生物化学活性分析、免疫分析以及组织和细胞的组织化学染色，多用于转基因植物的GUS基因表达分析。该试剂仅用于科研领域，不适用于临床诊断或其他用途。组成：自备材料：1、无水乙醇、甲醇2、去离子水3、小瓶或多孔板、显微镜操作步骤(仅供参考)：1、配制X-GlcASolution：取X-GlcAsolvent加入至X-GlcA中或取适量上述2种物质编号名称DP0011110mlStorage试剂(A):GUSBufferA50mlRT试剂(B):GUSBufferB0.2ml4℃避光试剂(C):GUSBufferC0.2ml4℃避光试剂(D):2×FixationBuffer25mlRT避光试剂(E):X-GlcA80mg-20℃避光试剂(F):X-GlcAsolvent1mlRT避光试剂(G):Deionizedwater100mlRT使用说明书1份溶解，轻轻Vortex混匀，即为X-GlcASolution，分装后，-20℃避光保存。2、按下列比例配制GUS染色液：组分体积GUSBufferA2.5mlGUSBufferB10μlGUSBufferC10μlDeionizedwater5.5ml甲醇2.0mlX-GlcASolution20μlTatalvolume～10ml3、固定(固定不是必须的步骤，如果不需要固定，直接进行操作步骤4)：①取转基因植物组织，入3～5ml清洁小瓶或多孔板中。②取适量FixationBuffer与去离子水等量稀释即获得FixationBuffer。加入1×FixationBuffer，使FixationBuffer完全浸没组织。室温孵育45min，弃液。③配制洗涤液：按GUSBufferA:去离子水=1:20稀释，即为洗涤液。用配制好的洗涤液漂洗3次，每次1min。4、加入适量GUS染色液，使GUS染色液完全浸没组织。5、用真空泵抽取小瓶或多孔板中的气体，抽取时间应大于。该步骤是为了抽取植物组织内的气体，并使染色液更容易进入组织内。6、立即盖紧瓶子或多孔板，孵育24h。随着孵育时间的延长，蓝色渐渐出现，当表达量较高时，GUS活性的部位或位点呈现蓝色或蓝色斑点。7、用乙醇脱去样本的叶绿素，一般样本浸没于乙醇。如有必要可重复该脱色步骤，以便彻底清除叶绿素。样本保存于乙醇中，可用肉眼或普通光学显微镜下观察。注意事项：1、配制好的GUS染色液可以4℃避光保存半个月。2、X-GlcASolution应避免反复冻融，否则染色效率会下降。3、由于组织特异性等原因，蓝色颜色反应可能不完全一致，应注意摸索具体实验条件。有效期：12个月有效。