酶工程技术

第一节酶的发酵生产第二节酶的分离纯化第三节酶分子的改造第十章酶工程技术1894年，日本科学家首次从米曲霉中提炼出淀粉酶，并将淀粉酶用作治疗消化不良的药物，从而开创了人类有目的地生产和应用酶制剂的先例。1911年，美国科学家从木瓜中提取出木瓜蛋白酶，并将木瓜蛋白酶用于除去啤酒中的蛋白质浑浊物。此后，酶制剂的生产和应用就逐步发展起1949年，科学家成功地用液体深层发酵法生产出了细菌α－淀粉酶，从此揭开了近代酶工业的序幕。1971年，第一次国际酶工程学术会议在美国召开，会议的主题就是固定化酶的研制和应用。20世纪70年代后期，酶工程领域又出现了固定化细胞技术。1986年，我国科学家利用固定化原生质体发酵生产碱性磷酸酶和葡萄糖氧化酶等相继获得成功，为酶工程的进一步发展开辟了新的途径。近20年来，随着基因工程的渗入，使酶的定向改造成为可能，所以在固定化酶、固定化细胞和固定化原生质体发展的同时，酶分子修饰技术、酶的化学合成以及酶的人工合成等方面的研究，也在积极地开展中，从而使酶工程更加显示出广阔而诱人的前景。酶的生产是指经过预先设计，并且通过人工控制而获得所需要的酶的过程。概括地说，酶的生产方法有提取法、发酵法和化学合成法三种。提取法是最早采用并且一直沿用至今的一种方法。它采用各种技术，直接从动植物或微生物的细胞或组织中将酶提取出来。提取法虽简单易行，但必须要有充足的原材料，这就使提取法的广泛应用受到了限制。发酵法是20世纪50年代以来生产酶的主要方法。它主要通过微生物发酵来获得人们所需要的酶。发酵法一般包括固体发酵、液体深层发酵、固定化细胞发酵和原生质体发酵等多种方式。化学合成法是20世纪60年代末出现的一种生产酶的新技术,目前仍然停留在实验室内合成的阶段。下面重点介绍酶的发酵生产。第一节酶的发酵生产商业用酶可来自于动植物组织和某些微生物。从动物组织或植物组织大量提取的酶，经常要涉及技术上、经济上以及伦理上的问题，使得许多传统的酶源已远远不能适应当今世界对酶的需求。为了扩大新老酶源，人们正越来越多地求助于微生物。微生物发酵生产酶的方法同其他发酵行业类似，首先必须选择合适的产酶菌株，然后采用适当的培养基和培养方式进行发酵，使微生物生长繁殖并合成大量所需的酶，最后将酶分离纯化制成一定的酶制剂。(一)优良产酶菌种的特点一个优良的产酶菌种应具备以下几点：(1)繁殖快，产酶量高，有利于缩短生产周期。(2)能在便宜的底物上良好生长。(3)产酶性能稳定，菌株不易退化，不易受噬菌体侵袭。(4)产生的酶容易分离纯化。(5)不是致病菌及产生有毒物质或其他生理活性物质的微生物，才能确保酶生产和应用的安全。一、优良产酶菌种的筛选(二)优良产酶菌种的筛选方法产酶菌种的筛选方法与发酵工程中微生物的筛选方法一致，主要包括以下几个步骤：含菌样品的采集，菌种分离，产酶性能测定及复筛等。1.胞外酶的产酶菌株的筛选方法2.胞内酶的产酶菌株的筛选方法如果是胞内酶，则可采用以下两种方法来确定：(1)固体培养法把菌种接入固体培养基中，保温数天，用水或缓冲液浸泡培养基，将酶抽提，测定酶活力，这种方法主要适用于霉菌；(2)液体培养法将菌种接入液体培养基后，静置或在摇床亡振荡培养一段时间(视菌种而异)，再测定培养物中酶的活力，通过比较，筛选出产酶性能较高的菌种供复筛使用。微生物酶的发酵生产是指在人工控制的条件下，有目的地利用微生物培养来生产所需的酶，其技术包括培养基和发酵方式的选择及发酵条件的控制管理等方面的内容。(一)培养基由于酶是蛋白质，酶的形成也是蛋白质的合成过程，因此微生物产酶的培养基要有利于蛋白质的合成。1.碳源是微生物细胞生命活动的基础，是合成酶的主要原料之一。2.氮源氮源可分为有机氮和无机氮，选用何种氮源因微生物或酶种类的不同而异。3.无机盐类应特别注意有些金属离子是酶的组成成分4.生长因子生长因子是指细胞生长必需的微量有机物，如维生素、氨基酸、嘌呤碱、嘧啶碱等。5.培养基的pH值在配制培养基时应根据微生物的需要调节pH值。二、微生物酶的发酵生产(二)酶的发酵生产方法酶的发酵生产方式有两种，一种是固体发酵，另一种是液体深层发酵。固体发酵法主要是用于真菌来源的商业酶生产，其中用米曲霉生产淀粉酶，以及用曲霉和毛霉生产蛋白酶在中国和日本已有悠久的历史。这种培养方法虽然简单，但是操作条件不容易控制。现在大多数的酶是通过液体深层发酵培养生产的。液体深层培养应注意控制以下条件：1.温度一般情况下产酶温度低于生长温度；2.通气和搅拌为提高氧气的溶解度，应对培养液加以适当的通气和搅拌；3.pH的控制在发酵过程中要密切注意控制培养基pH值的变化。有些微生物能同时产生几种酶，可以通过控制培养基的pH值以影响各种酶之间的比例，例如当利用米曲霉生产蛋白时，提高pH值有利于碱性蛋白酶的形成，降低pH值则主要产生酸性蛋白酶。(三)提高酶产量的措施在酶的发酵生产过程中，为了提高酶的产量，除了选育优良的产酶细胞外，还可以采用一些与酶发酵工艺有关的措施，例如添加诱导物、控制阻遏物浓度等。1.添加诱导物对于诱导酶的发酵生产，在发酵培养基中添加诱导物能使酶的产量显著增加。2.降低阻遏物浓度可采用难于利用的碳源，或采用分次添加碳源的方法使培养基中的碳源保持在不致于引起分解代谢物阻遏的浓度。3.表面活性剂有些表面活性剂对酶分子有—定的稳定作用，可以提高酶的活力。4.添加产酶促进剂产酶促进剂是指那些能提高酶产量但作用机理尚未阐明的物质。它可能是酶的激活剂或稳定剂，也可能是产酶微生物的生长因子，或有害金属的螯合剂。第二节酶的分离纯化酶的种类繁多，性质各异，分离纯化方法不尽相同，即便是同一种酶，也因其来源不同、酶的用途不同，而使分离纯化的步骤不一样。由于酶很不稳定，在提取时容易变性失活，因而提取酶时应注意：(1)温度。整个提纯操作应尽可能在低温下(0～4℃)进行，以防止蛋白水解酶对目的酶的破坏作用(尤其是在有机溶剂或无机盐存在下更应注意)。(2)pH值。在提纯过程中一般采用缓冲液作为溶剂，防止过酸或过碱。对一特定的酶，溶剂pH值的选择应考虑酶的pH稳定性以及酶的溶解度。(3)盐浓度。因为大多数蛋白质具有盐溶性质，所以在提取过程中可选用合适浓度的盐溶液以促进蛋白质溶解。但当盐浓度过高时，酶容易变性。(4)搅拌。剧烈搅拌容易引起蛋白质变性，提纯应避免剧烈搅拌和产生泡沫。(5)酶液是微生物生长的良好培养基，在提纯过程中应尽可能防止微生物对酶的破坏。1.破碎细胞除了胞外酶的提取以外，所有胞内酶均需将细胞壁破碎后方可进一步抽提。破碎细胞有许多方法，动植物细胞常用高速组织捣碎机和组织匀浆器破碎，而微生物细胞的破碎有机械破碎法、酶法、化学试剂法和物理破碎法等多种。2.溶剂抽提大多数酶蛋白都可用稀酸、稀碱或稀盐溶液浸泡抽提。选用何种溶剂和抽提条件视酶的溶解性和稳定性而定。3.离心分离离心分离是酶分离提纯中最常用的方法，主要用于除去发酵液中的菌体残渣或抽提过程中生成的沉淀物。4.浓缩由于发酵液或酶抽提液中酶的浓度一般都比较低，必须经过进—步纯化以便于保存、运输和应用。5.干燥为了酶制剂的长时间的运输、储存，防止酶变性，往往需对酶进行干燥，制成含水量较低的制品。常用的干燥方法有真空干燥、冷冻干燥、喷雾干燥等。一、酶制剂的制备(一)根据酶分子大小和形状的分离方法1.离心分离；2.差速离心和等密度梯度离心分离；３.凝胶过滤；４.透析与超滤(二)根据酶分子电荷性质的分离方法1.离子交换层析；2.层析聚焦；3.电泳；4.等电聚焦电泳(三)根据酶分子专一性结合的分离方法１.亲和层析；２.免疫吸附层析；３.染料配体亲和层析；４.共价层析(四)根据分配系数的分离方法二、酶的纯化与精制三、酶的纯度与酶活力所谓纯酶是相对的而不是绝对的，即使得到结晶，也未见得是单一的酶蛋白，因为蛋白的混合物也会结晶。酶的纯度可用酶的比活力来衡量，比活力是以每毫克蛋白所具有的酶活力单位数。酶的比活力随酶的纯度的提高而提高。酶的保存条件的选择必须有利于维护酶天然结构的稳定性，保存酶应注意：１.温度酶的保存温度一般在０～４℃。２.缓冲液大多数酶在特定的pH值范围内稳定，偏离这个范围便支会失活。３.氧防护由于巯基等酶分子基团或Fe-S中心等容易为分子氧所氧化，故这类酶应加巯基保护剂或在氩或氮气中保存。４.蛋白质的浓度及纯度一般地说，酶的浓度越高，酶越稳定，制备成晶体或干粉更有利于保存。此外，还可通过加入酶的各种稳定剂如底物、辅酶、无机离子等来加强四、酶制剂的保存第三节酶分子的改造改变酶特性有两种主要的主法。一是通过分子修饰的方法来改变已分离出来的天然酶的结构；二是通过生物工程方法改造编码酶分子的基因从而达到改造酶的目的。一、酶分子修饰酶分子修饰是指通过主链的剪接切割和侧链的化学修饰对酶分子进行改造。二、生物酶工程生物酶工程主要包括三方面内容：①用基因工程技术大量生产酶。②修饰酶基因，产生遗传修饰。③设计出新酶基因，合成自然界从未有过的酶。要构建一个具有良好产酶性能的菌株，必须具备良好的宿主——载体，一个理想的宿主应具备以下几个特性：(1)所希望的酶占细胞总蛋白量的比例要高，能以活性形式分泌；(2)菌体容易大规模培养，生长无特殊要求，且能利用廉价的原料；(3)载体与宿主相容，克隆酶基因的载体能在宿主中稳定维持；(4)宿主的蛋白酶尽可能少，产生的外源酶不会被迅速降解；(5)宿主菌对人安全，不分泌毒素。酶作为一种催化剂，已被广泛地应用于轻工业的各个生产领域。近几十年来，随着酶工程的迅猛发展，酶在生物工程、生物传感器、环保、医药等方面的应用也日益扩大，可以说酶已成为国民经济中不可缺少的一部分，人们的衣、食、住、行及其他方面的新技术几乎都离不开酶。三、酶的应用