分子生物学技术在肿瘤检测及治疗中的应用

分子生物学技术在肿瘤检测及治疗中的应用ApplicationofMolecularBiologyTechnologyinTumorDetectionandTreatment目录01肿瘤的防治历史P302PCR技术简介及其衍生技术P4~604单管荧光定量PCR技术P805实时荧光定量PCR技术的优越性P903反转录·聚合酶链式扩增RT-PCRP706实时荧光定量PCR技术应用于肿瘤P10CONTENTS2肿瘤防治历史•半个世纪多以来，随着医学技术的发展，人类已经基本上控制了以往主要威胁人类健康的传染病，而肿瘤、心血管等疾病逐渐成为人类健康的主要疾病，其中肿瘤的治疗尤为困难。传统的肿瘤治疗主要以外科手术为主，后期发展的化疗、放疗成为治疗肿瘤的主要方法。但在临床的实际应用上这些方法均有其局限性，疗效也不尽如人意。•随着研究的深入，人们发现细胞基因的恶变是肿瘤发生的主要机制，在肿瘤研究领域的大量研究成果显示肿瘤的发生、发展、治疗和预后与肿瘤细胞内部基因有关。癌基因的表达增加和突变，在许多肿瘤早期和良性的阶段就可出现。PCR技术不但能有效的检测基因的突变，而且能准确检测癌基因的表达量，可据此进行肿瘤早期诊断、分型、分期和预后判断。3PCR技术简介及其衍生技术•聚合酶链式反应（PolymeraseChainReaction）是一种分子生物学技术，模仿DNA体内复制的机制，在体外进行扩增特异的DNA片段。这种方法不必依赖大肠杆菌或酵母菌等生物体。这种技术是在模板DNA为引物，四种脱氧核苷酸存在的条件下，依赖DNA聚合酶的酶促合成反应。它可以在1～2h就能将所需基因扩增几百万倍，使极微量的所需DNA达到极易检测的水平。•随着PCR技术的逐步发展，其衍生技术也在以几块的速度发展，目前已达数十种。主要有逆转录PCR，多重PCR，免疫PCR，巢式PCR，荧光PCR，定量PCR等等。•这些技术的发展不仅仅发展了PCR技术，而且在分子生物学和医学等领域的科学研究上带来了深刻的影响。特别是在与肿瘤有关的基因的分析上发挥着重要的作用。4PCR的基本特点01高敏感性灵敏度可达到Pg级，甚至达到Fg级水平，使极微量的单拷贝特定核苷酸在短时间内扩增到几百万倍。02高特异性扩增的基因片段能与原基因片段保持不变。03操作简便过去的方法完成一项试验少则几周，多则几个月。应用全自动DNA扩增仪，整个PCR过程均由电脑控制，只需数小时即可完成整个试验过程，对表本要求也不高，用极微量的粗制标本就可获取目的产物5010203040506检测恶性肿瘤特异性标志物检测恶性肿瘤染色体易位检测肿瘤相关病毒检测基因重排检测抗癌基因检测活化的癌基因PCR在肿瘤检测诊断方面的意义6反转录·聚合酶链式扩增RT-PCRRT—PCR（ReverseTranscription-PolymeraseChainReaction）是将RNA的反转录（RT）和cDNA的聚合酶链式扩增（PCR）相结合的技术。首先经反转录酶的作用，从RNA合成cDNA，再以cDNA为模板，在DNA聚合酶作用下扩增合成目的片段。RT—PCR技术灵敏而且用途广泛，可用于检测细胞中基因表达水平、细胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的cDNA序列。作为模板的RNA可以是总RNA、mRNA或体外转录的RNA产物。无论使用何种RNA，关键是确保RNA中无RNA酶和基因组DNA的污染。用于反转录的引物可视实验的具体情况选择随机引物、OligodT及基因特异性引物中的一种。对于短的不具有发夹结构的真核细胞mRNA，3种都可。7单管荧光定量PCR技术•FQ—PCR的反应体系中除了普通PCR所需的引物外，还有一条荧光探针，探针的5`端标记了荧光报告基团，3`端标记了荧光淬灭基团，当这条探针保持完整时，荧光淬灭基团抑制荧光报告基团发出荧光。PCR反应开始后，随着DNA链的延伸，Taq酶的5`-3`外切酶活性将荧光探针切断，荧光淬灭基团的作用消失，荧光报告基团就发出了荧光信号，荧光信号的强弱与PCR的产物数量成正比，根据测量到的荧光信号强弱，通过分析软件得到样本的原始拷贝数。•单管荧光定量PCR（FluorogenicQuantitativePCR,FQ-PCR）技术是融合了PCR技术与DNA探针杂交技术的优点，实验的整个过程只在加样时打开1次反应管，在PCR的每个循环中可以直接监测到荧光信号的变化，根据PCR反应酶动力学特点分析软件会自动对DNA进行定量，因此也有人称FQ-PCR为实时荧光定量PCR（Real-timeFluorogenicQuantitativePCR）。8实时荧光定量技术的优越性常规检测mRNA表达主要是RT-PCR技术，它是将mRNA分子的cDNA序列进行了扩增，从而为用非常少量的模板分析mRNA提供了可能。但这种常规的RT-PCR技术敏感性还不是很高，极大地限制了它在癌细胞微转移方面的临床应用。实时荧光定量RT-PCR技术是基因时代一项用于检测mRNA的新技术，是临床检测和基础研究中不可缺少的重要研究方法，包括绝对定量PCR和相对定量PCR。实时荧光定量RT-PCR与常规RT-PCR技术相比在特异性、灵敏度、精确性等方面都具有更大的优势，该技术的特点是可以减少PCR后操作，在比较不同浓度的mRNA方面具有非常宽的动力学范围。9实时荧光定量PCR技术应用于肿瘤•在肿瘤分子诊断上的应用肿瘤的本质是细胞内基因发生了改变，是一种多基因异常的疾病。癌基因表达变化在许多肿瘤早期和良性阶段就已出现，该技术不但能有效监测基因的表达变化，而且能准确监测其表达量，可据此进行肿瘤的早期诊断、分型、和预后判断。eg：端粒酶hTERT基因、慢性粒细胞性白血病ER基因、肿瘤MDR1基因等的检测•肿瘤基因表达研究实时荧光定量RT-PCR方法能检测各种组织细胞中基因的表达丰度，从而分析基因的表达调控、监控mRNA的表达模式、检测组织中少量存在的基因、跟踪细胞群体中的克隆型、定量分析基因在不同组织中的转录水平。eg：检测黑色素瘤中的细胞因子白细胞介素-10（IL-10）、转化生长因子β1、β2（TGF-β1、β2）和γ干扰素（IFN-γ）的基因表达情况。10随着基因科学和分子生物学发展，各种PCR的技术的研究将会不断深入，成为未来分子生物学实验室的重要研究工具，在基础和临床医学研究领域将会有更加广阔的前景。11•1.PCR技术在肿瘤检测及治疗中的应用1001-5116（2001）06-0049-03•2.ApplicationofFluorogenicQuantitavePCRinTumorResearch2004，1(5)：323-326•3.•4.ApplicationofReal-timeFluoresceneQuantitativeRT-PCRTechnologytoCancerResearch1671-170X(2013)01-0069-0312参考文献谢谢观看~13