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第1讲基因工程-2-1.基因工程的诞生(Ⅰ)。2.基因工程的原理及技术(含PCR技术)(Ⅱ)。3.基因工程的应用(Ⅱ)。4.蛋白质工程(Ⅰ)。5.实验:DNA的粗提取与鉴定。-3-核心梳理提能探究考向感悟归纳总结基因工程的工具1.基因工程的概念(1)供体:提供目的基因。(2)操作环境:体外。(3)操作水平:分子水平。(4)原理:基因重组。(5)受体:表达目的基因。(6)本质:目的基因在受体体内的表达。(7)优点:定向改造生物的遗传性状。-4-核心梳理提能探究考向感悟归纳总结2.基因工程的基本工具-5-核心梳理提能探究考向感悟归纳总结(1)限制酶只能用于切割目的基因。(×)(2)DNA连接酶能将两碱基通过氢键连接起来。(×)(3)E·coliDNA连接酶既可连接平末端,又可连接黏性末端。(×)(4)载体质粒通常采用抗生素合成基因作为筛选标记基因。(×)(5)载体的作用是携带目的基因并将其导入受体细胞中,使之稳定存在并表达。(√)(6)外源DNA必须位于重组质粒的启动子和终止子之间才能进行复制。(×)-6-核心梳理提能探究考向感悟归纳总结1.用限制酶切割载体和获得的目的基因时需注意哪些问题?提示:①获取目的基因和切割载体时,经常使用同一种限制酶(也可使用能切出相同末端的不同限制酶),目的是产生相同的黏性末端或平末端。②获取一个目的基因需限制酶切割两次,共产生四个黏性末端或平末端。③选择限制酶切割位点时,必须保证标记基因的完整性,以便于检测。-7-核心梳理提能探究考向感悟归纳总结2.图1和图2分别是EcoRⅠ限制酶和SmaⅠ限制酶的作用示意图。请据图回答问题。图1图2-8-核心梳理提能探究考向感悟归纳总结(1)请说出EcoRⅠ限制酶和SmaⅠ限制酶识别的碱基序列及切割的位点。提示:EcoRⅠ限制酶识别的碱基序列是GAATTC,切割位点在G和A之间;SmaⅠ限制酶识别的碱基序列是CCCGGG,切割位点在C和G之间。(2)以上实例说明限制酶有何特性?提示:说明限制酶具有专一性。-9-核心梳理提能探究考向感悟归纳总结考向1限制性核酸内切酶和DNA连接酶的作用1.(2019湖南郴州二模)甘蔗黄叶综合症是一种由甘蔗黄叶病毒引起的禾本科植物病症,科学家通过甘蔗黄叶病毒外壳蛋白基因(简称CP蛋白基因)转化植物来获得抗病转基因新品种。(1)首先从患黄叶综合症的甘蔗病叶中提取RNA,此过程中为了防止RNA被分解,需加入抑制剂,以提取的RNA为模板通过获得cDNA。(2)对获取的cDNA进行PCR扩增,在此反应体系中,除了模板DNA、四种脱氧核苷酸外,还需加入,获得的大量cDNA需要在4℃的低温下保存备用,原因是。-10-核心梳理提能探究考向感悟归纳总结(3)将cDNA和质粒用同一种限制酶切割,产生相同的平末端,再用(填“E·coliDNA连接酶”或“T4DNA连接酶”)将二者进行连接。在培养基上接种、培养大肠杆菌作为受体细胞,同时加入一定量的CaCl2低温冷却液,目的是制备细胞,其具有的特殊功能是。(4)为检测大肠杆菌是否产生CP蛋白,需要将病毒颗粒注射到兔子体内,并从血清中分离获得作为检测剂。答案:(1)RNA酶逆转录(2)引物、Taq酶(热稳定DNA聚合酶)高温条件下,DNA分子中的氢键易断裂,双螺旋结构被破坏,发生变性(3)T4DNA连接酶感受态能吸收周围环境中的DNA分子(4)CP蛋白抗体(黄叶病毒外壳蛋白抗体)-11-核心梳理提能探究考向感悟归纳总结解析:(1)RNA酶可将RNA水解,因此为了防止RNA被分解,需加入RNA酶抑制剂。以RNA为模板获得cDNA的过程称为逆转录。(2)采用PCR技术扩增目的基因的条件有:模板DNA、四种脱氧核苷酸、引物、Taq酶(热稳定DNA聚合酶)。获得的大量cDNA需要在4℃的低温下保存备用,原因是高温条件下,DNA分子中的氢键易断裂,双螺旋结构被破坏,发生变性。(3)DNA连接酶包括E·coliDNA连接酶、T4DNA连接酶。这两类酶都能连接黏性末端。T4DNA连接酶还可以连接平末端,但连接平末端时的效率比较低。用CaCl2处理微生物细胞可使其成为感受态细胞,其具有的特殊功能是能吸收周围环境中的DNA分子。(4)为检测大肠杆菌是否产生CP蛋白,需要将病毒颗粒注射到兔子体内,并从血清中分离获得CP蛋白抗体(黄叶病毒外壳蛋白抗体)作为检测剂。-12-核心梳理提能探究考向感悟归纳总结考向2载体的作用和特点2.(2016全国Ⅰ卷)某一质粒载体如下图所示,外源DNA插入到Ampr或Tetr中会导致相应的基因失活(Ampr表示氨苄青霉素抗性基因,Tetr表示四环素抗性基因)。有人将此质粒载体用BamHⅠ酶切后,与用BamHⅠ酶切获得的目的基因混合,加入DNA连接酶进行连接反应,用得到的混合物直接转化大肠杆菌。结果大肠杆菌有的未被转化,有的被转化。被转化的大肠杆菌有三种,分别是含有环状目的基因的大肠杆菌、含有质粒载体的大肠杆菌、含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌。回答下列问题。-13-核心梳理提能探究考向感悟归纳总结(1)质粒载体作为基因工程的工具,应具备的基本条件有(答出两点即可),而作为基因表达载体,除满足上述基本条件外,还需具有启动子和终止子。(2)如果用含有氨苄青霉素的培养基进行筛选,在上述四种大肠杆菌细胞中,未被转化的和仅含环状目的基因的细胞是不能区分的,其原因是;并且的和的细胞也是不能区分的,其原因是。在上述筛选的基础上,若要筛选含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌单菌落,还需使用含有的固体培养基。(3)基因工程中,某些噬菌体经改造后可以作为载体,其DNA复制所需的原料来自。-14-核心梳理提能探究考向感悟归纳总结答案:(1)能自我复制、具有标记基因(2)二者均不含有氨苄青霉素抗性基因,在该培养基上均不生长含有质粒载体含有插入了目的基因的重组质粒(或含有重组质粒)二者均含有氨苄青霉素抗性基因,在该培养基上均能生长四环素(3)受体细胞-15-核心梳理提能探究考向感悟归纳总结解析:(1)基因工程中的载体应具备如下条件:必须有一个至多个限制酶切割位点;具有自我复制能力;具有标记基因;对宿主细胞无害。(2)未转化的和仅含环状目的基因的细胞不能在含有氨苄青霉素的培养基上生长,两者不能区分;而含有质粒载体的和含有重组质粒的细胞在含有氨苄青霉素的培养基上都能生长,两者也不能区分。因目的基因插入位点在四环素抗性基因上,四环素抗性基因被破坏,丧失了原有的功能,故含有重组质粒的大肠杆菌不抗四环素。将获得的单个菌落各挑取少许分别接种到含有四环素的培养基上,不能生长的即为所筛选的菌落,即含有重组质粒的大肠杆菌。(3)噬菌体是营寄生生活的,利用受体细胞内的原料进行自身DNA的复制和蛋白质的合成。-16-核心梳理提能探究考向感悟归纳总结1.切割某种目的基因的限制酶的选择根据目的基因两端的限制酶切割位点选择合适的限制酶。(1)应选择切割位点位于目的基因两端的限制酶,如图甲可选择PstⅠ。(2)不能选择切割位点位于目的基因内部的限制酶,如图甲不能选择SmaⅠ。(3)为避免目的基因和质粒的自身环化和随意连接,也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒,如图甲也可选择用PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶(但要确保质粒上也有这两种酶的切割位点)。-17-核心梳理提能探究考向感悟归纳总结2.载体上标记基因的作用载体上的标记基因一般是一些抗生素抗性基因。目的基因要转入的受体细胞没有抵抗相关抗生素的能力。当含有抗生素抗性基因的载体进入受体细胞后,抗性基因在受体细胞内表达,使受体细胞能够抵抗相应抗生素,所以在受体细胞的培养体系中加入该种抗生素就可以只保留转入载体的受体细胞,原理如下图所示:-18-核心梳理提能探究考向感悟归纳总结基因工程的基本操作程序1.目的基因的获取(1)目的基因:主要是指编码蛋白质的基因。(2)获取目的基因的方法①直接分离法:从自然界已有的物种中分离,如从基因组文库或cDNA文库中获取。②人工合成a.如果基因比较小,核苷酸序列又已知,可以通过DNA合成仪用化学方法直接人工合成。b.以RNA为模板,在逆转录酶的作用下人工合成。(3)扩增目的基因:利用PCR技术扩增目的基因。①PCR的原理:DNA复制。-19-核心梳理提能探究考向感悟归纳总结②PCR反应过程过程说明图解变性当温度上升到90℃以上时,双链DNA解聚为单链复性温度下降到50℃左右,两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合延伸72℃左右时,TaqDNA聚合酶有最大活性,可使DNA新链由5'端向3'端延伸-20-核心梳理提能探究考向感悟归纳总结③结果:上述三步反应完成后,一个DNA分子经复制形成了两个DNA分子,随着重复次数的增多,DNA分子的数量以2n的形式增加。PCR的反应过程都是在PCR扩增仪中完成的。-21-核心梳理提能探究考向感悟归纳总结2.基因表达载体的构建——基因工程的核心(1)目的①使目的基因在受体细胞中稳定存在,并且可以遗传给下一代。②使目的基因能够表达和发挥作用。(2)基因表达载体的组成:启动子+目的基因+终止子+标记基因(如抗生素抗性基因)。(3)基因表达载体的构建过程-22-核心梳理提能探究考向感悟归纳总结3.将目的基因导入受体细胞(连线)教材深挖将目的基因导入受体细胞并整合到线粒体DNA或叶绿体DNA上,能否稳定遗传?为什么?提示:一般不能。如果仅把目的基因整合到线粒体DNA或叶绿体DNA上,细胞分裂可能导致目的基因丢失,因此无法稳定遗传。-23-核心梳理提能探究考向感悟归纳总结4.目的基因的检测与鉴定步骤检测内容方法分子水平检测第一步转基因生物的DNA上是否插入了目的基因DNA分子杂交技术(DNA和DNA之间)第二步目的基因是否转录出了mRNA分子杂交技术(DNA和mRNA之间)第三步目的基因是否翻译出蛋白质抗原—抗体杂交技术个体生物学水平鉴定抗虫或抗病接种实验,以确定是否有抗性以及抗性的程度-24-核心梳理提能探究考向感悟归纳总结(1)设计扩增目的基因的引物时不必考虑表达载体的序列。(×)(2)用PCR方法扩增目的基因时不必知道基因的全部序列。(√)(3)PCR体系中一定要添加从受体细胞中提取的DNA聚合酶。(×)(4)为培育抗除草剂的作物新品种,导入抗除草剂基因时只能以受精卵为受体。(×)(5)把目的基因导入双子叶植物一般采用农杆菌转化法。(√)-25-核心梳理提能探究考向感悟归纳总结基因工程四步曲中,哪些步骤中没有发生碱基互补配对?提示:只有第三步“将目的基因导入受体细胞”没有发生碱基互补配对,其他三步(目的基因的获取、基因表达载体的构建和目的基因的检测)中都发生了碱基互补配对。-26-核心梳理提能探究考向感悟归纳总结考向1目的基因的获取及基因表达载体的构建1.为从根本上解决水稻中的高植酸问题,可将植酸酶基因导入水稻,培育低植酸转基因水稻品种。下图是获取植酸酶基因的流程。(1)图中基因组文库(填“小于”“等于”或“大于”)cDNA文库。(2)B过程需要的酶是。(3)目的基因Ⅰ和Ⅱ除可从构建的文库中分离外,还可以分别利用图中和为模板直接进行PCR扩增,该过程中所用酶的显著特点是。-27-核心梳理提能探究考向感悟归纳总结答案:(1)大于(2)逆转录酶(3)DNAcDNA耐高温解析:分析获取植酸酶基因的流程图可知,图中基因组文库大于cDNA文库。B过程需要的酶应该是逆转录酶。目的基因Ⅰ和Ⅱ除可从构建的文库中分离外,还可以分别利用图中DNA和cDNA为模板直接进行PCR扩增,该过程中所用酶的显著特点是耐高温。-28-核心梳理提能探究考向感悟归纳总结考向2基因工程的操作程序2.(2019全国Ⅰ卷)基因工程中可以通过PCR技术扩增目的基因。回答下列问题。(1)基因工程中所用的目的基因可以人工合成,也可以从基因文库中获得。基因文库包括和。(2)生物体细胞内的DNA复制开始时,解开DNA双链的酶是。在体外利用PCR技术扩增目的基因时,使反应体系中的模板DNA解链为单链的条件是。上述两个解链过程的共同点是破坏了DNA双链分子中的。(3)目前在