多肽的固相合成-(经典版)

学员旅五队徐磊许金翔钟家伟王康尚立群王修楠•定义：以氨基酸为原料，用化学方法合成多肽或蛋白质。•目的：①确证天然多肽或蛋白质的结构；②生产天然的、在生物体内含量极微但有医疗或其他生物效用的多肽；③改变部分结构，研究其结构与功能的关系，并设计更有效的药物。•基本原理：将两个氨基酸合成一个二肽,基本点是将一个氨基酸的羧基与另一个氨基酸的氨基连结成肽键方法：将这些不希望参加反应的基团用一些特殊的化学试剂与之反应,使生成的基团对缩合反应不敏感,还能在肽合成后，在不破坏肽键及氨基酸结构的条件下将它们恢复成原先的基团。这一类试剂称保护试剂，形成的基团称保护基。关键：需要有措施使第1个氨基酸的氨基与第2个氨基酸的羧基不参与反应多肽的液相合成ClicktoaddTitleClicktoaddTitleClicktoaddTitleThemeGalleryisaDesignDigitalContent&ContentsmalldevelopedbyGuildDesignInc.ClicktoaddTitle•氨基保护•羧基保护ClicktoaddTitle•缩合•羧基脱除保护•缩合向C端延长•氨基脱除保护•缩合从N端延伸•氨基及羧基保护脱除•形成无保护的四肽1963年，R.B.梅里菲尔德提出固相合成的方法，避免了溶解问题。它的原理是将第1个氨基酸接到不溶的固体颗粒上,然后将保护的第2个氨基酸与之缩合。产物因在固体颗粒上，因此很容易将反应中剩余的试剂清洗干净。然后脱去保护基,再将第3个氨基酸与之缩合而成三肽。如此反复，只要反应产率非常高，就能合成很大的肽。最后将合成的肽从固体的支持物上切下，再经纯化，即可得相应的肽。弊端：上述反应都在溶剂中进行，称为溶液方法。因所用保护基都是疏水的,而肽键是亲水的,因此合成到一、二十肽时，使保护了的肽溶解便成了困难的问题。寻找合适的溶剂是液相法的一个难题。Diagram•固相合成法的诞生•多肽合成仪介绍•多肽的不稳定•活化基团Fmoc与tBoc固相合成法的诞生20世纪50年代1932190219721963EmilFischer有机化学家们MaxBergmannLouCarpinoMerrifield•1902年，EmilFischer首先开始关注多肽合成，由于当时在多肽合成方面的知识太少，进展也相当缓慢•到1932年，MaxBergmann等人开始使用苄氧羰基(Z)来保护α-氨基，多肽合成才开始有了一定的发展。•到了20世纪50年代，有机化学家们合成了大量的生物活性多肽，包括催产素，胰岛素等，同时在多肽合成方法以及氨基酸保护基上面也取得了不少成绩，这为后来的固相合成方法的出现提供了实验和理论基础。•1963年，Merrifield首次提出了固相多肽合成方法(SPPS)，这个在多肽化学上具有里程碑意义的合成方法，一出现就由于其合成方便，迅速，成为多肽合成的首选方法，而且带来了多肽有机合成上的一次革命，并成为了一支独立的学科——固相有机合成(SPOS)。•1972年，LouCarpino首先将9-芴甲氧羰基(FMOC)用于保护α-氨基，其在碱性条件下可以迅速脱除，10min就可以反应完全，而且由于其反应条件温和，迅速得到广泛使用，以BOC和FMOC这两种方法为基础的各种肽自动合成仪也相继出现和发展，并仍在不断得到改造和完善。同时，固相合成树脂，多肽缩合试剂以及氨基酸保护基，包括合成环肽的氨基酸正交保护上也取得了丰硕的成果。Diagram•固相合成法的诞生•多肽合成仪介绍•多肽的不稳定•活化基团Fmoc与tBoc多肽合成仪•第一代多肽合成仪•第二代多肽合成仪•第三代多肽合成仪多肽合成仪的发展第一代多肽合成仪•第一代多肽合成仪是以Beckman公司推出的Beckman990PeptideSynthesizer以及Vega’sBiotechnologies公司推出的Vega’s296PeptideSynthesizer为代表的，诞生在上世纪七十年代。第一代多肽合成仪back第二代多肽合成仪•第二代多肽合成仪是以ProteinTechnologies公司推出的PS3PeptideSynthesizer以及AdvancedChemTech公司推出的ACTpeptidesynthesizerModel90为代表的，诞生在上世纪八十年代。第二代多肽合成仪此两款设备也是目前市场上仍在销售的最早的多肽合成仪。back第三代多肽合成仪•第三代多肽合成仪是以AppliedBiosystems公司的ABI433peptidesynthesizer与CSBio公司的CS336为代表的无死角多肽合成仪为代表的，诞生在上世纪九十年代。Diagram•固相合成法的诞生•多肽合成仪介绍•多肽的不稳定•活化基团Fmoc与tBoc活化基团Fmoc与tBoc多肽固相合成法多肽合成是一个重复添加氨基酸的过程，固相合成顺序一般从C端（羧基端）向N端（氨基端）合成。固相合成法，大大的减轻了每步产品提纯的难度。为了防止副反应的发生，参加反应的氨基酸的侧链都是保护的。羧基端是游离的，并且在反应之前必须活化。固相合成方法有两种，即Fmoc和tBoc。Fmoc的循环3.洗脱和脱保护：多肽从柱上洗脱下来，其保护基团被一种脱保护剂（TFA）洗脱和脱保护。.2.激活和交联：下一个氨基酸的羧基被一种活化剂所活化。活化的单体与游离的氨基反应交联，形成肽键。在此步骤使用大量的超浓度试剂驱使反应完成。1.去保护：Fmoc保护的柱子和单体必须用一种碱性溶剂（piperidine）去除氨基的保护基团。•由于Fmoc比tBoc存在很多优势，现在大多采用Fmoc法合成具体合成由下列几个循环组成：Diagram•固相合成法的诞生•多肽合成仪介绍•多肽的不稳定•活化基团Fmoc与tBoc不稳定性问题多肽的不稳定性是其制剂研究中存在的主要问题之一，其原因较多。脱酰胺氧化消旋水解变性β-消除…..不稳定性添加剂冻干提高稳定性的主要途径定向突变化学修饰演讲人：许金翔PPT制作：徐磊钟家伟材料收集：尚立群王修楠王康DiagramTitleAddyourtitleinhere-Yourtextinhere-YourtextinhereAddyourtitleinhere-Yourtextinhere-YourtextinhereAddyourtitleinhere-Yourtextinhere-YourtextinhereAddyourtitleinhere-Yourtextinhere-YourtextinhereDiagramTextinhere01.Title•Addyourtextinhere•Addyourtextinhere•Addyourtextinhere02.Title•Addyourtextinhere•Addyourtextinhere•Addyourtextinhere03.Title•Addyourtextinhere•Addyourtextinhere•AddyourtextinhereThemeGalleryisaDesignDigitalContent&ContentsmalldevelopedbyGuildDesignInc.ThemeGalleryisaDesignDigitalContent&ContentsmalldevelopedbyGuildDesignInc.ThemeGalleryisaDesignDigitalContent&ContentsmalldevelopedbyGuildDesignInc.DiagramAddYourText•ClicktoaddText•ClicktoaddText•ClicktoaddText•ClicktoaddText•ClicktoaddText•ClicktoaddTextTitleAddyourtext3-DPieChartA.ProductsAddyourtextinhereAddyourtextinhereAddyourtextinhereAddyourtextinhereAddyourtextinhereAddyourtextinhereAddyourtextinhereB.ProductsAddyourtextinhereAddyourtextinhereAddyourtextinhereAddyourtextinhereAddyourtextinhereDiagram10%5%60%25%ThemeGalleryisaDesignDigitalContent&ContentsmalldevelopedbyGuildDesignInc.TextinhereTextinhereTextinhereTextinhere•Yourtextinhere•Yourtextinhere•Yourtextinhere•Yourtextinhere•Yourtextinhere•Yourtextinhere•Yourtextinhere•Yourtextinhere•YourtextinhereClicktoaddText•Yourtextinhere•Yourtextinhere•YourtextinhereDiagramThemeGalleryisaDesignDigitalContent&ContentsmalldevelopedbyGuildDesignInc.ThemeGalleryisaDesignDigitalContent&ContentsmalldevelopedbyGuildDesignInc.TitleTitleTitleTitleTitleTitleDiagramTitleTitleTitleThemeGalleryisaDesignDigitalContent&ContentsmalldevelopedbyGuildDesignInc.•Addyourtextinhere•Addyourtextinhere•AddyourtextinhereDiagramTitleTitle•Textinhere•TextinhereTitle•TextinhereTitleThemeGalleryisaDesignDigitalContent&ContentsmalldevelopedbyGuildDesignInc.DiagramClicktoaddTextAddyourtextinhere-Yourtextinhere-YourtextinhereThemeGalleryisaDesignDigitalContent&ContentsmalldevelopedbyGuildDesignInc.ClicktoaddTextClicktoaddTextAddyourtextinhere-Yourtextinhere-YourtextinhereAddyourtextinhere-Yourtextinhere-YourtextinhereDiagramAddyourtextinhereAddyourtextinhereTitleABAddyourtextinhereDAddyourtextinhereCAddyourtextinhereAddyourtextinhereAddyourtextinhereAddyourtextinhere