搜索
MV_RR_CNJ_0051光栅型荧光分光光度计检定规程1.光栅型荧光分光光度计检定规程的说明编号JJG(教委)025-1996名称(中文)光栅型荧光分光光度计检定规程(英文)Verificationregulationforgratingfluorescencespectrophotometer归口单位国家教育委员会起草单位国家教育委员会主要起草人田笠卿批准日期1997年1月22日实施日期1997年4月1日替代规程号无适用范围本规程适用于新安装、使用中和维修后的各种光栅型荧光分光光度计(以下简称仪器)的检定。主要技术要求1.外观要求2.安装条件3.检定环境4.检定设备5.检定项目和检定方法是否分级无检定周期(年)1附录数目3出版单位科学技术文献出版社检定用标准物质相关技术文件备注2.光栅型荧光分光光度计检定规程的摘要2范围本规程适用于新安装、使用中和维修后的各种光栅型荧光分光光度计(以下简称仪器)的检定。2.1原理物质被某一波长的光照射后，会发射出比照射波长稍长的光，这种光称为荧光，它的过程是当物质的分子处于基态时，吸收光后，可跃迁到激发态，各激发态分子相互撞击而以无辐射能量损失的形式回到第一激发态的昀低振动能级，这一振动能级的分子在返回基态时，所发射的光称为荧光，但当它转入亚稳的三重线级，停留一段时间，返回至基态时所发出的光称为磷光，荧光(磷光)强度与物质浓度的关系为F＝K’ϕI0(1－eκLC)式中F——荧光强度K’——仪器常数 ϕ——量子效率I0——激发光强度κ——荧光物质的摩尔吸收系数L——荧光池厚度C——荧光物质浓度2.2构成仪器结构如图1所示，光源与检测器成直角方式安排。检测器光源激发单色器样品室发射单色器记录仪图1仪器结构原理图2.2.1光源仪器的光源有高压汞蒸气灯和氙弧灯，后者能发射出强度较大的连续光谱，且在300nm～400nm范围内强度几乎相等，故较常用。2.2.2单色器置于光源和样品室之间的为激发单色器或第一单色器，置于样品室和检测器之间的为发射单色器或第二单色器，常采用光栅为单色器。2.2.3样品室通常由石英池(液体样品用)或固体样品架(粉末或片状样品)组成。测量液体时，光源与检测器成直角安排；测量固体时，光源与检测器成锐角安排。2.2.4检测器一般用光电管或光电倍增管作检测器。3计量单位采用我国公布的法定计量单位。4计量要求新安装的各种仪器应符合仪器说明书中规定的计量要求，其技术指标应优于本规程表1中的规定。使用中和维修后的各种仪器应符合本规程表1中规定的技术指标。表1仪器技术指标计量类别技术指标波长准确度≤±0.5nm波长重复性0.3nm检出限5.0×10－11g/ml线性误差≤±2.0％信噪比(S/N)参照出厂说明的指标，已测出检出限的仪器，可不进行此项检定光谱校正误差带光谱校正的这类仪器在指定光谱校正的波长范围内进行校正荧光池成套性配套使用的荧光池的配套误差应不大于1.0％5技术要求5.1外观要求仪器应有下列标志：仪器名称、型号、制造厂名、出厂时间和仪器编号。5.2安装条件5.2.1仪器应平稳地置于工作台上，各紧固件均应紧固良好，各调节旋钮、按键和开关均能正常工作，无松动现象，电缆线的插接件均应紧密配合，接触良好，外观不应有妨碍正常工作的机械损伤。5.2.2仪器的波长度盘，狭缝带宽刻度，指示仪表度盘刻线、刻字应粗细均匀清晰，数显仪器的数字显示不应断线和缺线。5.2.3带记录仪的仪器，记录仪的满量程时间应符合出厂要求、记录仪绘图画线应清晰，不间断。5.2.4仪器所配荧光池各透光面应光洁，不得有灰尘、油污、划痕及任何裂纹。5.3检定环境5.3.1环境温度20℃±5℃，且相对稳定。相对湿度不大于70％。电源电压220V±22V。5.3.2仪器应平稳地放在工作台上，无强光直射在仪器上。5.3.3仪器周围无强磁场、电场干扰，无振动，无强气流影响。5.3.4检定前仪器应预热20min。5.4检定设备5.4.1便携式笔型低压石英汞灯或高压石英汞灯，其光谱线波长值见附录A。5.4.2工作标准荧光池，其配套误差应不大于0.5％。5.4.3秒表，分度值0.1s。5.4.4调压变压器(500VA)。5.4.5试验电压500V的兆欧表。5.4.6配制标准溶液所需的设备及器材见附录B。5.4.70.05mol/LH2SO4溶液。5.4.8以0.05mol/LH2SO4作溶剂的硫酸奎宁标准溶液，其ρ(g/ml)分别为：5.0×10－11，1.00×10－7，2.00×10－7，4.00×10－7，6.0×10－7，8.0×10－7和1.00×10－6。5.5检定项目和检定方法5.5.1直观检定用目力观察应符合本规程安装条件(5.2)和检定环境(5.3)之要求。5.5.2波长准确度与重复性测定5.5.2.1激发单色器波长准确度与重复性的测定5.5.2.1.1将发射单色器置零级位置，灯室内正确安好笔型汞灯，响应时间“快”，扫描速度“慢”，通带“窄”，横坐标“小”，选择特殊方式中的“波长核对”。5.5.2.1.2以附录A汞谱线作参考波长，允许从附录表A—1中任选分布均匀的5条谱线作参考波长。从短波向长波方向对激发单色器扫描。记录仪昀大读数时的波长为测量值，连续测量3次。按5.5.2.1.3计算波长准确度和重复性。5.5.2.1.3按公式(1)计算波长正确度：Δλ＝—13i∑=31λi－λr(1)式中λi——波长测量值λr——汞灯参考波长值按公式(2)计算波长重复性：δλ＝max|λi－—13i∑=31λi|(2)按公式(3)计算波长准确度：Uλ＝Δλ±δλ(3)5.5.2.2发射单色器波长准确度与重复性的测定5.5.2.2.1将激发单色器波长置零级位置，其余条件同5.5.2.1.1。5.5.2.2.2检定方法参照5.5.2.1.2。5.5.2.2.3计算方法参照5.5.2.1.3。5.5.3分辨率测定5.5.3.1激发单色器的分辨率5.5.3.1.1检定条件同5.5.2.1.1。5.5.3.1.2扫描激发单色器应能分辨出汞三线365.02nm，365.48nm和366.33nm所对应的测量峰值。5.5.3.2发射单色器的分辨率5.5.3.2.1检定条件同5.5.2.1.1。5.5.3.2.2扫描发射单色器应能分辨出汞三线365.02nm，365.43nm和366.33nm所对应的测量峰值。5.5.4检出限与信噪比测定5.5.4.1检出限5.5.4.1.1以0.05mol/LH2SO4溶液作空白，根据仪器类别选取对应浓度的硫酸奎宁标准溶液作样品。灵敏度置高档，选择适当的狭缝宽度，将激发波长置于350nm，扫描发射波长找出测量峰值对应的λEM，将发射波长固定在λEM。5.5.4.1.2分别对空白溶液和标准样品溶液连续交替11次测定，如果测量中有一次被认为是由于外界干扰或操作失误而引起粗大误差，必须将该测量数据剔除。5.5.4.1.3由公式(4)计算每次测定的荧光强度：Fi＝Fi1－Fi0(4)式中Fi1——标准溶液的荧光强度Fi0——空白溶液的荧光强度由公式(5)计算荧光强度测量平均值：F－＝—1ni∑=n1Fi(5)式中n——测量次数由公式(6)计算单次测量的标准偏差：i∑=n1(Fi－F－)2S＝n－1(6)式中n——测量次数由公式(7)计算检出限：DL＝――Fρ×2S(7)式中DL——检出限，指仪器能给出的二倍于标准偏差读数的标准溶液的质量浓度ρ——标准溶液的质量浓度5.5.4.2信噪比(S/N)置激发波长350nm，激发和发射狭缝宽度10nm。用二次蒸馏水，调节灵敏度使发射波长为397nm时，仪器示值在40％左右。再将发射波长退回到300nm，调仪器零位。扫描发射单色器，记录300nm～430nm发射光谱曲线。发射波长397nm附近的峰值即为S。然后在峰值处采用时间扫描记录2min，记录噪声曲线波动昀大的峰值即为N。5.5.5线性误差5.5.5.1置激发波长350nm，发射波长450nm，以0.05mol/LH2S04溶液作空白，调节仪器灵敏度和狭缝宽度，使表2中的质量浓度昀大的溶液示值在90％附近。表2硫酸奎宁标准溶液标准溶液编号i123456ρi/(g/ml)1.00×10－72.00×10－74.00×10－76.0×10－78.0×10－71.00×10－65.5.5.2交替测定空白和各浓度标准溶液的荧光强度，每种溶液重复测量3次。5.5.5.3由式(4)，(5)计算每次测量的荧光强度及测量平均值。由公式(8)计算平均荧光系数k：1F-ik＝6i∑=n1ρi(8)式中F-i——质量浓度为ρi的溶液对应的荧光强度测量平均值ρi——标准溶液的质量浓度由公式(9)计算线性误差：F-i－kρiai＝(kρi)(9)5.5.6光谱峰值强度的重复性测定置激发波长350nm，激发和发射狭缝宽度为10nm，用1.00×10－7g/ml的硫酸奎宁溶液，调节灵敏度，使发射波长为450nm时，示值在80％左右，继续照射3min后，对发射波长从365nm至500nm重复扫描3次。由公式(10)计算重复性：δF＝max|Fi－—13i∑=31Fi|(10)式中Fi——每次测量荧光峰值。5.5.7光谱校正误差的测定5.5.7.1激发光谱校正按仪器光谱校正说明书进行光谱校正误差检定。5.5.7.2发射光谱校正按仪器光谱校正说明书进行光谱校正误差检定。5.5.8荧光池的成套性测定5.5.8.1用检定合格的荧光分光光度计进行荧光池成套性的检定。5.5.8.2置激发波长350nm，发射波长450nm，荧光池中装入1.00×10－6g/ml硫酸奎宁，放入光路时带有标志的一面正对进光方向。将仪器示值调至95％，测量其它各荧光池的示值，凡示值差不大于1.0％的荧光池可以配成一套。5.5.9其它对于测量方式没有完全包括在本规程范围内的其它类型的荧光分光光度计，其主要指标参照上述检定方法进行检定，技术要求参照仪器说明书给出的指标。6计量管理6.1检定结果处理经检定后的仪器，发给检定证书(附录C)。在检定结论中需明确说明被检定的仪器属于何种级别、是否合格、存在的问题和建议等。6.2检定周期检定周期为1年，在此期间，当条件改变(例如更换光源灯、光电倍增管等)或对测量结果有怀疑时，都应进行检定。注:需要查阅全文,请与出版发行单位联系.