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项目编号___07012___________国家大学生创新性实验计划项目结题表课题名称：磷酰胆碱基团改性温敏水凝胶第一作者：王琼程冬所在院系：高分子科学系指导教师：钟伟导师单位（部门）：复旦大学高分子科学系填表日期：2008年3月24日复旦大学教务处一、项目信息表项目申请人姓名学号院系专业固定电话手机电子邮件王琼0444029高分子科学系高分子材料与工程[e-mail]程冬0444009高分子科学系高分子材料与工程[e-mail]赵翔宇0544122高分子科学系高分子材料与工程[e-mail]唐倩倩0544046高分子科学系高分子材料与工程[e-mail]指导教师钟伟学位/职称副教授研究方向生物材料和医疗器械实验室名称生物医用材料实验室联系人王琼联系方式13918720392研究成果成果形式■论文□报告□其他成果是否发表□是■否发表论文题目发表期刊名称期刊类别□SCI期刊□EI期刊□ISTP期刊□其他期刊作者排序发表日期卷次、页码0444029王琼导师：钟伟磷酰胆碱改性温敏水凝胶二、结题报告磷酰胆碱基团改性温敏水凝胶摘要：通过磷酰胆碱基团化学修饰方法，对聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯（PEO-PPO-PEO）三嵌段共聚物进行了改性。通过测定临界胶束浓度CMC、临界胶束温度CMT以及用流变学方法测定凝胶态模量，结果表明，端基改性对水凝胶的凝胶化过程有着显著的影响，同时改性产物还表现出了较好的pH响应性和生物相容性。关键词：聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯三嵌段共聚物；磷酰胆碱；端基改性1．引言水凝胶作为一类新型的合成生物材料，其研究与应用都吸引着广泛的关注。本文所选择研究的PEO-PPO-PEO嵌段共聚物体系(商品名为Poloxamer®或Pluronic®)即是这样一类凝胶，它们有固态、液态和糊状等各种形态,相对分子质量从1000到14000，浓缩的Poloxamer®溶液在高温时能够形成可逆凝胶,当温度降低时又会变成液态,凝胶温度依赖于聚合物的组成和溶液浓度。该类凝胶,可用于治疗烧伤和其他的创伤。研究表明，一定临床相关浓度的Poloxamer®118能够减少红细胞的凝聚和血液粘度,润滑细胞表面,减少细胞与细胞间的摩擦1。Pluronic®F-127是一种具有快速可逆凝胶转变行为的非离子表面活性剂,Raymond2对其作为暂时的栓塞剂进行了研究。把3mL22%Pluronic®F-127注射入猎犬的右侧肺叶动脉和右侧肾脏动脉,形成暂时的闭塞。研究结果表明,一周内没有出现病理的变异。由于该类水凝胶具有优良的细胞亲和性和可降解性，还可能作为可注射的细胞载体支架，应用于组织工程和组织修复。该类温敏凝胶还被广泛用作可注射的水凝胶药物释放体系,因为水凝胶基质可以使包埋的药物稳定可控地到达体液中,通过把药物包在水凝胶中制成纳米微球、微米微球,然后注射到体内来进行药物的控制释放。也可把大单体和药物一起注入体内,然后经交联形成控释体系3。原位形成的水凝胶可以和组织牢固地结合,有效地控制了水凝胶和药物的释放范围,这样就可以在一个特定的部位形成水凝胶,在病灶处精确地释放包覆的药物。正是由于水凝胶的这些优良的性能，其在药物释放4-6、组织工程7-10等领域都得到了较好的应用并已形成商品化，但它的潜力不仅限于此，在生物材料领域，一种智能药物释放体系正在被呼唤并且吸引了越来越多的研究者。如何开发出具0444029王琼导师：钟伟磷酰胆碱改性温敏水凝胶有更好生物相容性的各种可注射的化学刺激响应体系、物理刺激响应体系以及生物信号响应体系、纳米药物释放体系以满足人们在疾病治疗、保健、计划生育及卫生等方面的需求，显然已经成为了水凝胶类生物材料的研究热点。研究表明，对水凝胶三嵌段共聚物体系进行端基化学改性，不仅会影响其微观组装过程，同时也会对其宏观物理性能产生令人惊奇的影响11,12。在本文中，我们合成了一系列用磷酰胆碱基团(COP)进行端基改性的PEO-PPO-PEO三嵌段共聚物。磷酰胆碱类化合物是天然生物膜中含量最高的一种磷脂化合物，这样改性得到的具有亲水的两性端基和疏水的烷烃分子链的产物的结构同天然生物膜非常相似。同时磷酰胆碱独特的内盐结构和互相间的物理交联效应被预期会给三嵌段共聚物体系带来额外的离子强度或pH等的环境响应性能。为此，我们着重对磷酰胆碱对温敏水凝胶的性能影响作了详细的考察，包括其临界胶束浓度CMC、临界胶束温度CMT的变化以及对pH值的响应性和生物相容性等等。2.实验部分2.1原料2.1.1PEO-PPO-PEO三嵌段共聚物商品名Pluronic®，BASF公司，牌号分别为F-87、F-88、F-108和F127，改性前于40°C真空烘箱中干燥过夜。2.1.2合成2-烷氧基-2-氯代-1,3,2-二氧磷杂环戊烷（COP）所需原料1.乙二醇（EG）：分子量62.05；沸点197℃/760mmHg纯化：用无水硫酸镁干燥24小时后，用金属钠回流，然后减压蒸馏。2．三氯化磷（PCl3）：分子量137.33；沸点75.9℃纯化：回流加热赶出氯化氢气体，约1小时，然后蒸馏，取76℃馏分3．二氯甲烷（CH2Cl2）：分子量84.94；沸点39.8℃纯化：多次加入少量浓H2SO4，摇匀然后静置，至酸层保持无色。然后加入无氧化二磷粉末，蒸馏并取恒沸点馏分。4．苯：沸点80.1℃；nD20：1.5011；纯化：先用浓硫酸浸泡1小时，除去噻吩，然后反复用水洗涤，之后用无氧化二磷回流干燥并蒸馏。2.2合成2.2.1COP的合成0444029王琼导师：钟伟磷酰胆碱改性温敏水凝胶CH2Cl2按照文献13所述方法，如下路线合成COP。OHOH+ClPClClCH2ClOPOCl+O2OPOOCl+HOOCOEt3NTHFOPOOOOCONCH3CH3CH3+OOCOPOONOMPC的合成OHOH+ClPClClCH2ClOPOCl+O2OPOOCl+HOOCOEt3NTHFOPOOOOCONCH3CH3CH3+OOCOPOONOMPC的合成OPOOCl在一个配有恒压滴液漏斗、回流冷凝管（连有液封管以便与空气隔绝）和磁力搅拌器的三口瓶中，加入一定量的PCl3与干燥CH2Cl2的混合溶液，然后缓慢滴入一定量的干燥EG，滴加的速度控制在HCl气体的生成不至于太剧烈，时间约2.5小时。滴毕，立即换用蒸馏装置，先常压蒸馏除掉溶剂及其部分副产物；当温度升到60℃时，立即减压蒸馏，得到无色液体CUP。在一个配有回流冷凝管（连液封管以便与空气隔绝）、气体导管和磁力搅拌器的三口瓶中，加入一定量的CUP和干燥苯。在搅拌状态下，缓慢通入干燥的O2。控制温度，使体系微回流。反应20小时后结束，用旋转蒸发仪除掉溶剂，然后减压蒸馏，即得到无色液体,即产物COP。2.2.2PC-Pluronic的合成0.01molPluronic®F-87或F-88、F-108、F127和0.02mol三乙胺(TEA)在通氮气环境下混合溶于100mL干燥THF。在磁力搅拌下，将0.02molCOP和50mLTHF的溶液缓缓滴入，用时3小时。以上操作均在0°C下进行。体系继续搅拌2小时，缓慢恢复至室温后，旋蒸除去溶剂，得到中间产物COP-PCL。随后将COP-Pluronic和40mL三甲胺(TMA)在乙腈中的干燥饱和溶液一起混合。溶液缓缓加热到65°C并磁力搅拌48小时.反应产物被小心加热除去剩余三甲胺，加入到冷的石油醚中沉淀.重复在THF/石油醚中的溶解/沉淀过程之后，得到经过磷酰胆碱端基改性的Pluronic(PC-87或PC-88、PC-108、PC-127)，产物随后于真空烘箱中干燥至衡重。2.3表征2.3.1NMR表征对改性前后三嵌段共聚物F108,F127,PC108和PC127用1H-NMR谱进行表→Pluronic®→+O2→0444029王琼导师：钟伟磷酰胆碱改性温敏水凝胶征，使用仪器BrukermodelAVANCEDMX-500，以四甲基硅烷(TMS)为参比，溶剂(CDCl3)质子信号为内部标准。2.3.2GPC表征为进一步表明磷酰胆碱基团被成功引入PEO-PPO-PEO三嵌段共聚物体系，使用凝胶色谱法(GPC,Agilent1100配备3支PL-gel柱)分别测定F108,F127,PC108和PC127的流出时间，THF流速0.50mL/min-1，柱温40°C.2.3.3CMC及CMT测定CMC测定：配制三嵌段共聚物的系列浓度水溶液，以测量折光率变化转折点的方法测定CMC,对比F-87、PC-87和F-88、PC-88的CMC变化。CMT测定：配制三嵌段共聚物的0.1%wt水溶液，在使用SYP-III玻璃恒温水浴逐渐升温的条件下用DDS-6700型电导率仪测量其电导率变化转折点，对比F-127、PC-127的CMT变化，同时分别测定F127和PC127在pH=3的HCl溶液中的CMT,对比改性前后对pH的响应性。2.3.4流变学方法测定凝胶态模量使用高级流变扩展系统（ARES）,通过摆动剪切方式，记录样品F-108，F-127,PC-108和PC-127的存储模量(G’)和损耗模量(G”),以研究改性前后的聚合物凝胶性质。所有样品均为20%wt水溶液，并在测量之前于4°C的环境下存放3天，以便于体系足够分散。采用10rad/s的剪切速率，测量剪切模量随温度的变化，温度从10°C逐渐升到60°C，升温速率为0.5°C每分钟。另外，为研究环境变化如PH对产品性能的影响，同时测量了样品在PH为3的HCl溶液中的剪切模量。2.3.5生物相容性评价测试样品F-108、F-127、PC-108和PC-127的部分凝血活酶时间（APTT），凝血酶元时间(PT)和凝血酶时间(TT)来表征其生物相容性。使用仪器sysmexCA-1500，试剂DADEBEHRINGActin,DADEBEHRINGThromburel’s和DADEBEHRINGTest-ThrombinReagents。3结果与讨论3.1NMR定性表征使用1HNMR谱来表征PEO-PPO-PEO三嵌段共聚物的端基，得到如图1所示0444029王琼导师：钟伟磷酰胆碱改性温敏水凝胶的谱图，从谱图中可以看到，由于原料三嵌段共聚物的端基是羟基，F-127和F108在2.51ppm处有化学位移。而在改性后的PC-127和PC-108的谱图中，羟基的化学位移峰消失了，取而代之的是三个新的峰（图中a、b、c），PC-127中位于2.57ppm,3.09ppm和4.25ppm处，PC-108中位于2.65ppm,3.10ppm和4.30ppm处，这些化学位移峰恰好和磷酰胆碱基团上的氢原子相对应，表明磷酰胆碱基团被成功的引入三嵌段共聚物体系。图1.三嵌段共聚物NMR表征结果3.2GPC的定性表征由图2的GPC表征结果可以明显地看到，改性后的PC-127和PC-108的流出时间,都较之前的F-127和F-108有所提前，表明改性之后，两种嵌段共聚物的分子量都有一定的增加，同时体系的分子量分布并没有明显的差异。GPC的表征结果同样为磷酰胆碱基团的成功引入提供了证据。图2.三嵌段共聚物的GPC表征结果3.3CMC和CMT测定结果3.3.1CMC结果使用折光率法测定改性前后三嵌段共聚物的CMC,得到折光率随浓度变化如图3所示。结果显示，改性之后的三嵌段共聚物的CMC都较之前有所减小，从F-87的5.91%w/v变化到PC-87的5.44%w/v,F-88的6.20%w/v到PC-88的5.67%w/v。0444029王琼导师：钟伟磷酰胆碱改性温敏水凝胶图3.改性前后三嵌段共聚物CMC测定结果(折光率法)表面活性物质在水中形成胶束所需的最低浓度称为临界胶束浓度，以CMC表示。临界胶束浓度可以作为表面活性剂的表面