实验三-血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳

实验三血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳醋酸纤维素薄膜电泳分析技术是目前临床常规测定中应用最广的方法，具有微量、快速、简便、吸附作用和电渗作用小、分离区带清晰、灵敏度及分辨率高等特点。醋酸纤维素薄膜还可进行透明化处理，便于照相和扫描计算结果。广泛应用于血清蛋白、血红蛋白、糖蛋白、脂蛋白、结合球蛋白、同工酶的分离和测定。【目的】1.掌握电泳法分离蛋白质的原理、操作方法。2.了解电泳法分离蛋白质的临床意义。【原理】带电粒子在电场中向与其电性相反的电极泳动的现象称为电泳。血清中各种蛋白质的等电点大多在pH4.0～7.3之间，在pH8.6的缓冲液中均带负电荷，在电场中都向正极移动。由于血清中各种蛋白质的等电点不同，因此在同一pH环境中所带负电荷多少不同，又由于其分子大小不同，所以在电场中泳动速度也不同。分子小而带电荷多者，泳动速度较快；反之，则泳动速度较慢。因此通过电泳可将血清蛋白质分为5条区带，从正极端依次分为清蛋白、α1球蛋白、α2球蛋白、β-球蛋白和γ球蛋白等，经染色可计算出各蛋白质含量的百分数。【器材】醋酸纤维素薄膜（2cm×8cm）、培养皿、滤纸、无齿镊、剪子、加样器（可用盖玻片或或微量加样器）、直尺、铅笔、玻璃板（8cm×12cm）、试管、试管架、吸管、电泳仪、电泳槽、分光光度计或吸光度扫描计。【试剂】1.巴比妥缓冲液(pH8.6，0.07mol/L，离子强度0.06)称取巴比妥钠12.76g、巴比妥1.66g，加500毫升蒸馏水，加热溶解。待冷至室温后，再加蒸馏水至1000毫升。2.氨基黑10B染色液称取氨基黑10B0.5g加入冰醋酸10ml、甲醇50ml,混匀，加蒸馏水至100ml。3.漂洗液甲醇45ml、冰醋酸5ml，混匀后加蒸馏水至100ml。4.洗脱液0.4mol／LNaOH溶液。5.透明液称取柠檬酸21g，N-甲基-2-吡咯烷酮150g，以蒸馏水溶解并稀释至500ml。【操作】1.准备将缓冲液加入电泳槽的两槽内，并使两侧的液面等高。裁剪尺寸合适的滤纸条，叠成四层贴在电泳槽的两侧支架上，一端与支架前沿对齐，另一端侵入电泳槽的缓冲液内，使滤纸全部湿润，此即“滤纸桥”（图3-1）。将醋酸纤维素薄膜切成2cm×8cm大小，在无光泽面的一端约1.5cm处，用铅笔轻划一直线，作为点样位置。然后将无光泽面向下，置于盛有巴比妥缓冲液的培养皿中浸泡，待充分浸透（约20分钟）即无白色斑点后取出，用洁净滤纸轻轻吸去表面的多余缓冲液。2.点样取少量血清于玻璃板上，用加样器取少量血清(约2～3μl)，加在点样线上，待血清渗入膜内，移开加样器。点样时应注意血清要适量，应形成均匀的直线，并避免弄破薄膜（图3-2）。8cm2cm1.5cm图3-2电泳点样位置示意图点样线＋－3.平衡与电泳将点样后的薄膜有光面朝上，点样的一端靠近负极，平直地贴于电泳槽支架的滤纸上，平衡约5分钟。盖上电泳槽盖，通电进行电泳。调节电压为100～160伏，电流0.4～0.6mA／cm宽，夏季通电45分钟，冬季通电60分钟，待电泳区带展开2.5～3.5cm时断电。4.染色用无齿镊小心取出薄膜，浸于染色液中1～3分钟（以清蛋白带染透为止）。染色过程中应轻轻晃动染色皿，使薄膜与染色液充分接触，薄膜量较多时，应避免彼此紧贴而影响染色效果。5.漂洗准备3个培养皿，装入漂洗液。从染色液中取出薄膜，依次在漂洗液中连续浸洗数次，直至背景无色为止。将漂净的薄膜用滤纸吸干，从正极端起依次为清蛋白（A）、α1、α2、β及γ-球蛋白（图3-3）。6.定量(1)洗脱法：取6支试管，编号，分别为A、α1、α2、β、γ和空白管。于清蛋白管加入0.4mol/LNaOH溶液4ml,其余5管加2ml。剪下各条蛋白区带，另于空白部分剪一条与各蛋白区带宽度近似的薄膜作为空白，分别浸入各管中，振摇数次，置37℃水浴20分钟，使色泽完全浸出。用620nm波长以空白管调零比色，读取各管吸光度，按下式计算：T=A×2+α1+α2+β+γ清蛋白%＝清蛋白管吸光度×2/T×100α1-球蛋白%＝α1-球蛋白管吸光度/T×100α2-球蛋白%＝α2-球蛋白管吸光度/T×100β-球蛋白%＝β-球蛋白管吸光度/T×100γ-球蛋白%＝γ-清蛋白管吸光度/T×100(2)扫描法：待染色的醋酸纤维素薄膜完全干燥，置透明液中约3分钟，取出贴于玻片上，薄膜完全透明。将已透明的薄膜放入全自动光密度计中，对蛋白区带进行扫描，自动绘出电泳图，并直接打印出各区带的百分含量。【注意事项】1.标本不能溶血，否则，β球蛋白浓度偏高。2．每次电泳时应交换电极，以使两侧电泳槽内缓冲液的正负离子相互交换，使缓冲液的pH维持在一定水平。3．电泳槽缓冲液的液面要保持一定高度，过低可能出现了球蛋白的电渗现象(向阴极移动)。同时，电泳槽两侧的液面应保持在同一水平面，否则，通过薄膜时有虹吸现象，将会影响蛋白质分子的泳动速度。4．电泳时电泳槽要密闭，以保持湿度，否则，薄膜水分蒸发干燥，使电流下降，分离不佳。5．电泳失败或图谱不理想的常见原因。(1)电泳图谱不整齐：①点样不均匀；②薄膜未完全浸透或温度过高致使膜面局部干燥或水分补给不足；③缓冲液变质；④电泳时薄膜放置不正，与电流方向不平行。(2)各蛋白区带分离不清晰：①点样过多；②电流过低，多由薄膜过于致密、吸水性差、导电能力差引起；③膜面干燥；④薄膜过薄。(3)清蛋白中间着色浅：①染色时间不够或染色液陈旧；②清蛋白含量过高，可减少血清用量或延长染色时间。(4)电泳速度慢：①电流过低；②供给薄膜的缓冲液不足，连接薄膜与缓冲液的滤纸或纱布过薄(一般需4层)；③温度过低，冬季电泳速度较夏季慢；④薄膜结构过于致密，导电性差；⑤缓冲液中水分蒸发，致使离子强度增大。6．样品要求点在粗糙面(无光泽面)，否则，样品很难吸人膜内。电泳时最好将点有样品的一面朝下，以防电泳过程中水分蒸发，影响电泳结果。7．染色时间以2分钟为佳(室温低时，时间可稍长)，若时间过长，可使α1球蛋白与染料结合率增加，导致α1球蛋白百分比上升。【正常参考值】清蛋白：57.45～71.73%α1-球蛋白：1.76～4.48%α2-球蛋白：4.04～8.28%β-球蛋白：6.79～11.39%γ-球蛋白：11.85～22.97%A/G1.24～2.36【临床意义】急慢性肾炎、肾病综合征、肾功能衰竭时，清蛋白降低，α1、α2和β-球蛋白升高；慢性活动性肝炎、肝硬化时，清蛋白降低，β、γ-球蛋白升高；急性炎症时，α1、α2-球蛋白升高；慢性炎症时，清蛋白降低，α2、γ-球蛋白升高；红斑狼疮、类风湿关节炎时，清蛋白降低，γ-球蛋白显著升高；多发性骨髓瘤时，清蛋白降低，γ-球蛋白升高，于β和γ-球蛋白区带之间出现“M”带。【结果及分析】【思考题】1.血清蛋白质电泳时为什么要将点样的一端靠近负极端？2.醋酸纤维素薄膜电泳可将血清蛋白依次分为哪几条区带，有哪些临床意义？