流式细胞术应用与进展

流式细胞术应用与进展(FlowCytometry,FCM)贾正才副教授TEL:68752345E-mail:[e-mail]生物医学分析测试中心一、流式细胞术BiomedicalAnalysisCenterFlowCytometryinmotioncellmeasure对处在液流中的细胞或其它生物微粒（如细菌）逐个进行多参数的快速定量分析和分选的技术。研究对象:单细胞悬液外周血、骨髓、细胞穿刺液、洗脱液、实体组织、培养细胞、细菌、藻类等。二、流式细胞仪发明过程BiomedicalAnalysisCenter1930年，Casperrsson和Thorell致力于细胞的计数；1940年，Coons用结合荧光素的抗体标记胞内蛋白；1953年，Taylor利用分层鞘流原理，成功设计红细胞光学自动计数器；1953年，Parker和Hutcheon描述一种全血细胞计数器装置，成为流式细胞仪的雏形；BiomedicalAnalysisCenter1967年，Kamemtsky和Melamed提出细胞分选方法；1969年，Fulwyler及其同事们发明第一台荧光检测细胞计；1972年，Herzenberg改进细胞分选器，能够检测出荧光抗体染色的细胞的较弱的荧光信号。1975年，Kochler和Milstein提出单克隆抗体技术。二、流式细胞仪发明过程FL2PESSCFSC电子系统计算机系统FL3PerCP,Cy5FL1FITCLightdetectors液流系统光学系统laser三、流式细胞仪基本结构BiomedicalAnalysisCenter荧光素的激发、发射波长与检测图例激光荧光抗体最大发射波长检测器488nmCD3-FITC519nm527/32nm488nmCD4-PerCP675nm670/20nm561nmCD25-TRITC572nm585/40nm561nmCD8-TexasRed615nm610/20nmnoexpressionCD3-FITCCD3-FITCCD4-PerCP四、流式分析常用荧光素BiomedicalAnalysisCenter1.有机小分子FITC、Cy5、Cy7、AlexaFlour、DyLight、TexasRed优点：☺容易标记☺标记抗体很稳定☺非常一致的发射光谱缺点：☺较小的光谱偏移(50-100nm)☺荧光容易淬灭BiomedicalAnalysisCenter2.荧光蛋白PE、APC、PerCP优点：☺稳定性好☺荧光强度高☺一致的发射光谱（不同供应商间差别大）缺点：☺分子量大☺标记较困难HCAM表达检测四、流式分析常用荧光素BiomedicalAnalysisCenter3.蛋白-小分子偶联物PE-Cy5、PE-Cy7、APC-Cy7、PE-TxRD蛋白-小分子偶联物发射荧光原理四、流式分析常用荧光素BiomedicalAnalysisCenter碘化丙啶(PI)嵌入到双链DNA和RNA碱基对中对碱基无特异性选择不能穿过正常细胞膜DAPI结合双链DNA小槽(AT碱基对)特异性比PI高可穿透正常细胞膜4.常用核酸染料PI和DAPI染细胞核四、流式分析常用荧光素BiomedicalAnalysisCenter相对细胞大小（前向角散射光–FSC）五、流式细胞术的参数与数据相对细胞颗粒密度和内部复杂度（侧向角散射光–SSC）染色细胞的相对荧光强度（荧光-Fluoresentlight）BiomedicalAnalysisCenter前向角散射光--FSC♠FSC信号收集方向与激光束相平行♠FSC与被测细胞相对大小及表面积相关FALSSensorLaserBiomedicalAnalysisCenter前向角散射光--FSCFSCisproportionaltorelativesize&cell-surfaceareaLaserbeamLaserbeamLargeparticleSmallparticleDetectorBiomedicalAnalysisCenter侧向角散射光--SSCFALSSensor90LSSensorLaser♠SSC信号收集方向与激光束相垂直(90°)♠SSC与被测细胞内部颗粒度和结构复杂度相关BiomedicalAnalysisCenter侧向角散射光--SSCSSCisproportionaltocellgranularityorinternalcomplexityLaserbeamLaserbeamSidescatterdetectorSidescatterdetectorHighgranularityparticleLowgranularityparticle基于FSC和SSC的全血散点图BiomedicalAnalysisCenterBiomedicalAnalysisCenter基于FSC和SSC的组织细胞散点图BiomedicalAnalysisCenter荧光强度(Fluoresenceintensity)♠荧光信号的强度:细胞表面或细胞内物质浓度BiomedicalAnalysisCenter染色细胞的相对荧光强度流式细胞分析结果直方图BiomedicalAnalysisCenter染色细胞的相对荧光强度流式细胞分析结果散点图流式细胞分选器示意图六、流式细胞分选原理流式细胞分选示意图1.在鞘液的包裹和推动下，细胞悬液中的细胞被排成单列，以一定速度从喷口喷出。2.喷嘴射出的液柱被分割成一连串液滴，每液滴含1个细胞。3.充电电路对选定细胞液滴充以正、负不同电荷。4.带电液滴携带细胞通过静电场而发生偏转，落入收集器。六、流式细胞分选原理BiomedicalAnalysisCenter1.细胞周期分析（DNA倍体分析）(cellcycle)七、流式细胞术的应用2.细胞凋亡分析(cellapoptosis)3.流式多色分析(multi-parameterexperiment)4.流式细胞术研究进展BiomedicalAnalysisCenter细胞周期分析分裂间期分裂期(M)BiomedicalAnalysisCenter流式细胞仪检测：细胞周期分析流式细胞仪检测图例BiomedicalAnalysisCenter结果解读：细胞周期分析细胞周期流式检测结果BiomedicalAnalysisCenter结果解读：细胞周期分析G0/G1期：63.08%G2/M期：8.83%S期：28.10%G2/G1为1.95峰的变异系数CV：3.38%细胞凋亡分析细胞凋亡不同时期的特点BiomedicalAnalysisCenterBiomedicalAnalysisCenter原理：1.细胞凋亡磷脂酰丝氨酸(PS)外翻2.AnnexinV与PS高亲和力结合细胞凋亡分析（AnnexinV/PI）PS3.PI无法进入正常活细胞4.坏死细胞/晚期凋亡细胞细胞膜受损annexinV、PI能进入细胞凋亡分析（AnnexinV/PI）流式细胞仪检测：BiomedicalAnalysisCenter设置欲分析检测的目的细胞门细胞凋亡分析（AnnexinV/PI）结果解读：BiomedicalAnalysisCenter细胞凋亡检测结果BiomedicalAnalysisCenter注意事项：1.设置必需的对照阴性对照、AnnexinV单染、PI单染2.洗涤细胞时应轻柔，减少对细胞的机械损伤3.根据细胞特性，选择合适的离心条件4.选择多种凋亡分析方法细胞凋亡分析（AnnexinV/PI）BiomedicalAnalysisCenter细胞凋亡分析（AnnexinV/PI）阴性对照结果图例阴性对照：确定阴性细胞和阳性细胞的界线。BiomedicalAnalysisCenter细胞凋亡分析（AnnexinV/PI）发射光谱交叠AnnexinV/PI单染：不同荧光素发射光谱交叠，导致假阳性产生。调节补偿，避免假阳性引起的实验结果错误。BiomedicalAnalysisCenter细胞凋亡分析（AnnexinV/PI）未调补偿调节补偿后BiomedicalAnalysisCenter应用：流式多色分析检测同一细胞上和/或细胞内多种分子的表达荧光抗体选择原则：1.根据目标分子情况，选择相应荧光抗体。2.不同荧光抗体上的荧光素不同。3.不同荧光素的最大发射波长相差越大越好。流式多色分析流式细胞仪检测：BiomedicalAnalysisCenter设置欲分析检测的目的细胞门流式多色分析结果解读：BiomedicalAnalysisCenter注意事项：1.根据流式细胞仪选选择荧光抗体激光器：488nm、635nm、355nm、561nm2.根据分子的表达情况选择荧光抗体PerCP≈APC-Cy7≈FITCPerCP-Cy5.5PEAPC=PE-Cy5弱表达：高荧光强度荧光素标记的抗体3.考虑荧光抗体间补偿的多少4.设置必需的对照同型对照、各抗体单染流式多色分析BiomedicalAnalysisCenter流式多色分析发射光谱交叠图例局限性：可同时检测的分子种类有限BiomedicalAnalysisCenter基本原理：1.传统流式细胞术与原子质谱法相结合2.过渡元素的同位素标记抗体3.流式细胞仪产生单细胞液滴，原子质谱检测每个细胞上同位素的数量、种类4.理论上可同时检测单细胞上/细胞内的100种以上的分子质谱流式细胞术(MassCytometry)流式细胞术研究进展基本原理：过渡元素质谱流式细胞术(MassCytometry)基本原理：BiomedicalAnalysisCenter质谱流式细胞术(MassCytometry)基本原理：质谱流式细胞术获得的细胞树状结构图圆点：表达分子种类相同的细胞圆点大小：细胞数目相邻圆点：表达分子种类相近颜色：分子表达强弱质谱流式细胞术(MassCytometry)BiomedicalAnalysisCenter优点：☺理论上可检测单细胞的100种以上的分子☺无需繁琐的荧光补偿☺细胞群的解析更清晰、信息量更大缺点：☺细胞被破坏，不能进行细胞分选☺灵敏度没有某些荧光燃料高质谱流式细胞术(MassCytometry)八、文献阅读Single-CellMassCytometryofDifferentialImmuneandDrugResponsesAcrossaHumanHematopoieticContinuumBendallSC,SimondsEF,QiuP,Amirel-AD,KrutzikPO,FinckR,BruggnerRV,MelamedR,TrejoA,OrnatskyOI,BalderasRS,PlevritisSK,SachsK,Pe'erD,TannerSD,NolanGP.Science.2011;332(6030):687-96.BiomedicalAnalysisCenterBiomedicalAnalysisCenterIntroduction1.Theoutlineofhematopoiesisisgenerallyunderstood.2.Acomprehensiveframeworkofitssystem-widepropertiesremainstobedetermined.3.Useofflowcytometryremainspracticallyconfinedtothemeasurementof6to10simultaneousparameters.4.Analysisatthe11-to15-parameterrangeispossiblebutlimitedbycompensation.BiomedicalAnalysisCenterExperimentDesign1.Simultaneouslymeasured34parametersineachsinglecellinhumanbonemarrow(BM)samples.2.In-depthanal